メガヌクレアーゼ

メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（12～40塩基対の二本鎖DNA配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼです。そのため、この部位は通常、どのゲノムにも1つしか存在しません。たとえば、I-SceIメガヌクレアーゼによって認識される18塩基対の配列は、平均してヒトゲノムの20倍の大きさのゲノムが偶然に1回見つかる必要があります（ただし、ミスマッチが1つある配列は、ヒトサイズのゲノムあたり約3回発生します）。そのため、メガヌクレアーゼは最も特異的な天然制限酵素であると考えられています。

メガヌクレアーゼの中でも、ホーミングエンドヌクレアーゼの LAGLIDADG ファミリーは、過去 15 年間にわたり、ゲノムとゲノム工学の研究にとって貴重なツールとなっています。メガヌクレアーゼは、非常にターゲットを絞った方法で配列を置き換え、除去、または変更するために使用できる「分子DNAハサミ」です。タンパク質工学によって認識配列を変更することで、ターゲット配列を変更できます。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、動物など、すべてのゲノム タイプを変更するために使用されます。メガヌクレアーゼは、特に人間の健康の分野で、たとえばウイルスの遺伝物質の除去や、遺伝子治療を使用した損傷した遺伝子の「修復」など、イノベーションへの幅広い道を開きます。

メガヌクレアーゼは、古細菌、バクテリア、ファージ、真菌、酵母、藻類、一部の植物など、多数の生物に存在します。これらは、核、ミトコンドリア、葉緑体など、細胞のさまざまな部分で発現します。これらの酵素は数百種類特定されています。

メガヌクレアーゼは、主に、ホーミングエンドヌクレアーゼとして総称されるイントロンエンドヌクレアーゼとインテインエンドヌクレアーゼの 2 つの主要な酵素ファミリーによって表されます。

自然界では、これらのタンパク質は、可動性遺伝要素、イントロンまたはインテインによってコード化されています。イントロンは、メガヌクレアーゼの発現によって相補的なイントロンまたはインテインフリーの対立遺伝子が切断される DNA の正確な位置に介入することで増殖します。インテインおよびグループ I イントロンの場合、この切断により、二本鎖 DNA 切断の 相同組換え修復によって、切断部位のイントロンまたはインテインの複製が起こります。

メガヌクレアーゼの実際の目的については、ほとんどわかっていません。メガヌクレアーゼをコードする遺伝物質は、宿主の遺伝物質を損傷することなく増殖し拡散する手段として、二本鎖 DNA 細胞修復メカニズムを自らの利益のために利用する寄生要素として機能すると広く考えられています。

ホーミングエンドヌクレアーゼには5つのファミリー、またはクラスがあります。^[1]最も広く普及し、最もよく知られているのはLAGLIDADGファミリーです。LAGLIDADGファミリーエンドヌクレアーゼは、主に真核単細胞生物のミトコンドリアと葉緑体に見られます。

このファミリーの名前は、このファミリーのすべてのタンパク質に多かれ少なかれ保存されているアミノ酸配列 (またはモチーフ) に対応しています。これらの小さなタンパク質は、コンパクトで密集した 3 次元構造でも知られています。

研究やゲノム工学で最も広く使用されている、最も特徴が明らかにされているエンドヌクレアーゼには、 I-SceI （パン酵母Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアで発見）、I-CreI（緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの葉緑体由来）、および I-DmoI（古細菌Desulfurococcus mobilis由来）などがあります。

最もよく知られている LAGLIDADG エンドヌクレアーゼは、ホモ二量体 (たとえば、同じタンパク質ドメインの 2 つのコピーで構成される I-CreI) または内部的に対称なモノマー (I-SceI) です。触媒ドメインを含む DNA 結合部位は、切断点の両側の 2 つの部分で構成されます。半結合部位は非常に類似しており、回文または半回文 DNA 配列に結合する場合もあれば (I-CreI)、非回文である場合もあります (I-SceI)。

メガヌクレアーゼは特異性が高いため、他の天然制限酵素に比べて精度が高く、細胞毒性がはるかに低い。メガヌクレアーゼは1990年代に特定され、その後の研究で、相同組換えを効率的に誘導し、^[2]突然変異を生成し、^{[3]読み枠を変更できるため、}ゲノム工学や遺伝子編集に特に有望なツールであることが示された。^[4]

しかし、実行可能なメガヌクレアーゼ誘導遺伝子組み換えは、利用可能なメガヌクレアーゼのレパートリーによって制限されていました。自然界には何百ものメガヌクレアーゼが存在し、それぞれの認識部位にわずかな変化を許容できるという事実にもかかわらず、特定の遺伝子を目的の位置で切断できるメガヌクレアーゼが見つかる可能性は極めて低いです。いくつかのグループは、目的の認識部位を標的とする新しいメガヌクレアーゼを設計することに注目しました。

最も先進的な研究と応用は、LAGLIDADG ファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに関するものです。

テーラーメイドメガヌクレアーゼを作成するために、主に 2 つのアプローチが採用されています。

• 既存のメガヌクレアーゼの特異性を、アミノ酸配列に少数の変異を導入することで改変し、その後、天然認識部位の変異に基づいて機能性タンパク質を選択する。^{[5] [6] [7]}
• より根本的な選択肢は、メガヌクレアーゼの本来の高い多様化において重要な役割を果たす特性、すなわち異なる酵素のタンパク質ドメインを会合または融合する可能性を利用することである。^{[8] [9]}この選択肢により、メガヌクレアーゼAの半分の部位とタンパク質Bの半分の部位からなる新しい認識部位を持つキメラメガヌクレアーゼを開発することが可能になる。I-DmoIとI-CreIのタンパク質ドメインを融合することにより、この方法を使用してE-DrelとDmoCreという2つのキメラメガヌクレアーゼが作成された。^[10]

これら 2 つのアプローチを組み合わせることで、高い有効性と特異性を維持しながら、新しい酵素を作成する可能性を高めることができます。Cellectis の科学者は 1999 年から遺伝子編集に取り組んでおり、ホモ二量体メガヌクレアーゼ I-CreI やその他のメガヌクレアーゼの骨格から 20,000 を超えるタンパク質ドメインのコレクションを開発しました。^[11]これらを組み合わせることで、研究室や産業目的で機能的なキメラのテーラーメイド ヘテロ二量体を形成することができます。

もう一つのバイオテクノロジー企業であるプレシジョン・バイオサイエンスは、指向性ヌクレアーゼエディター（DNE）と呼ばれる完全に合理的な設計プロセスを開発しました。これは、ゲノム内のユーザー定義の場所をターゲットにして変更する人工メガヌクレアーゼを作成することができます。^{[12] 2012年に}バイエルクロップサイエンスの研究者はDNEを使用して、綿の植物のDNAに遺伝子配列を組み込み、事前に決定された場所に正確にターゲットを合わせました。^[13]

ゲノム工学におけるメガヌクレアーゼの使用における最近の進歩の 1 つは、転写活性化因子様 (TAL) エフェクターの DNA 結合ドメインをハイブリッド ヌクレアーゼに組み込むことです。これらの「メガ TAL」は、TAL エフェクターのエンジニアリングの容易さと高い DNA 結合特異性と、メガヌクレアーゼの高い切断効率を兼ね備えています。^{[14]さらに、メガヌクレアーゼは、エラーが発生しやすい}非相同末端結合 を促進し^[15]、特定の遺伝子座での変異誘発イベントの頻度を高めるために、DNA 末端処理酵素に融合されています。^[16]

冒頭の段落で述べたように、18 塩基対の配列を持つメガヌクレアーゼが偶然に 1 回見つかるには、平均してヒトゲノムの 20 倍の大きさのゲノムが必要です。計算は 4 ¹⁸ /3x10 ⁹ = 22.9 です。ただし、非常に類似した配列の方がはるかに一般的であり、許容されるミスマッチが増えるほど頻度が急速に増加します。

たとえば、1 つの塩基対を除いてすべて同一である配列は、平均して 4 ¹⁷ /18x3x10 ⁹ = 0.32 ヒトゲノム相当ごとに 1 回、つまりヒトゲノムあたり 3 回、偶然に発生します。2 つの塩基対を除いてすべて同一である配列は、平均して 4 ¹⁶ /(18C2)x3x10 ⁹ = 0.0094 ヒトゲノム相当ごとに 1 回、つまりヒトゲノムあたり 107 回、偶然に発生します。

これは、酵素が完全な識別力を持たないため重要です。ヌクレアーゼは、配列が完全に一致していなくても、いくらか作用する可能性があります。そのため、ミスマッチが 1 つある配列に対するヌクレアーゼの活性は、ミスマッチがない場合よりも低く、ミスマッチが 2 つある場合はさらに低くなりますが、それでもゼロではありません。非常に類似しているが同一ではないこれらの配列を除外することは、ゲノム工学において克服すべき重要な問題です。

DNAのメチル化とクロマチン構造はメガヌクレアーゼ消化の有効性に影響を与える。^{[17] [18]}したがって、これらの酵素の実際の応用には、標的配列の遺伝的およびエピジェネティックな文脈を徹底的に考慮することが必要である。

2014年12月、USPTOはメガヌクレアーゼを用いた体外ゲノム編集に関する特許8,921,332を発行した。^[19] この特許はCellectisに独占的にライセンス供与された。^[20]

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