プライム編集

プライム編集は、分子生物学における「検索と置換」ゲノム編集技術であり、生物のゲノムを改変することができる。この技術は、標的のDNA部位に新しい遺伝情報を直接書き込む。この技術では、改変された逆転写酵素に融合された触媒的に障害されたCas9エンドヌクレアーゼと、標的部位を識別し、標的DNAヌクレオチドを置き換えるための新しい遺伝情報を提供するプライム編集ガイドRNA（pegRNA）からなる融合タンパク質を使用する。この技術は、二本鎖切断（DSB）やドナーDNAテンプレートを必要とせずに、標的の挿入、削除、および塩基対塩基の変換を仲介する。 ^[1]

この技術は、医学遺伝学における潜在的な用途のため、主流メディアの注目を集めています。この技術は、CRISPR/Cas9や塩基編集を含む前駆体ゲノム編集技術に似た方法論を利用しています。プライム編集は、遺伝性疾患のいくつかの動物モデル^{[2] [3] [4]}や植物^[5]で使用されています。

プライム編集には3つの主要な要素が含まれます。^[1]

• プライム編集ガイドRNA （pegRNA）は、（i）編集対象となる標的ヌクレオチド配列を識別し、（ii）標的配列を置き換える新しい遺伝情報をコードすることができます。pegRNAは、プライマー結合部位（PBS）と逆転写酵素（RT）テンプレート配列を含む拡張されたシングルガイドRNA（sgRNA）で構成されています。ゲノム編集中、プライマー結合部位により、切断されたDNA鎖の3'末端がpegRNAにハイブリダイズし、RTテンプレートは編集された遺伝情報の合成のテンプレートとして機能します。^[1]
• Cas9 H840Aニッカーゼとモロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV） 逆転写酵素が融合した融合タンパク質。^{[1] [6] [7]}
  • Cas9 H840Aニッカーゼ： Cas9酵素には、DNA配列を切断できる2つのヌクレアーゼドメイン、非標的鎖を切断するRuvCドメインと標的鎖を切断するHNHドメインが含まれています。Cas9にH840A置換を導入すると、840番目のアミノ酸ヒスチジンがアラニンに置き換えられ、HNHドメインが不活性化されます。RuvC機能ドメインのみでは、触媒的に障害のあるCas9は1本鎖のニックを導入するため、ニッカーゼという名前が付けられています。[ 8 ^]
  • M-MLV逆転写酵素：一本鎖RNAテンプレートからDNAを合成する酵素。^[1]
• 融合タンパク質のCas9 H840Aニッカーゼ部分に指示を与え、編集されていないDNA鎖に切り込みを入れる単一ガイドRNA（sgRNA）。^[1]

ゲノム編集は、ペグRNAと融合タンパク質を細胞に導入することで行われます。多くの場合、導入は細胞にベクターを導入することで行われます。融合タンパク質は内部移行すると、標的DNA配列に切り込みを入れ、ペグRNAのRTテンプレート部分の逆転写を開始（プライミング）するために使用できる3'-ヒドロキシル基を露出させます。これにより、2つのDNAフラップを含む分岐中間体が生成されます。3'フラップには新しく合成された（編集された）配列が含まれ、5'フラップには不要な編集されていないDNA配列が含まれます。次に、5'フラップは構造特異的エンドヌクレアーゼまたは5'エキソヌクレアーゼによって切断されます。このプロセスにより、3'フラップライゲーションが可能になり、編集された1つの鎖と編集されていない1つの鎖で構成されるヘテロ二本鎖DNAが作成されます。再アニールされた二本鎖DNAには、編集が行われた場所にヌクレオチドの不一致が含まれます。ミスマッチを修正するために、細胞は内因性ミスマッチ修復 （MMR）メカニズムを利用しますが、その結果は2つ考えられます。(i)編集された鎖の情報が相補鎖にコピーされ、編集が永久にインストールされる。(ii)編集された鎖に元のヌクレオチドが再組み込まれ、編集が除外される。^[1]

この技術の開発中、その有効性を高めるためにコンポーネントにいくつかの変更が加えられました。^[1]

最初のシステムでは、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素をCas9 H840AニッカーゼC末端に融合した。検出可能な編集効率が観察された。^[1]

DNA-RNA親和性、酵素処理能、および熱安定性を高めるために、5つのアミノ酸置換がM-MLV逆転写酵素に組み込まれました。次に、変異型M-MLV RTをPE1に組み込み、(Cas9 (H840A)-M-MLV RT(D200N/L603W/T330P/T306K/W313F))を作成しました。PE1よりも効率が向上しました。^[1]

PE2 によって挿入された編集は、その有効性は高まっているものの、編集された鎖の DNA ミスマッチ修復によって除去される可能性があります。DNA ヘテロ二本鎖の解決中にこの問題を回避するために、追加のシングル ガイド RNA (sgRNA) が導入されます。この sgRNA は、pegRNA によって導入された編集された配列と一致するように設計されていますが、元の対立遺伝子とは一致しません。これは、融合タンパク質の Cas9 ニッカーゼ部分に、元のニックとは反対側の近くのサイトで編集されていない鎖にニックを入れるように指示します。編集されていない鎖にニックを入れると、細胞の自然な修復システムが編集された鎖の情報を相補鎖にコピーし、編集が永続的にインストールされます。^{[1]ただし、このシステムには欠点があり、変更されていない鎖にニックを入れると、望ましくない}インデルがさらに発生する可能性があります。^[9]

プライムエディター4はPE2と同じ機構を利用しているが、優性負性MMRタンパク質MLH1をコードするプラスミドも含んでいる。優性負性MLH1は本質的に阻害によって内因性MLH1をノックアウトすることができ、それによって細胞のMMR応答を減少させ、プライム編集効率を高める。^[9]

プライムエディター5はPE3と同じ機構を利用しているが、優性負性MLH1をコードするプラスミドも含まれている。PE4と同様に、これにより内因性MMR応答のノックダウンが可能になり、プライム編集の効率が向上する。^[9]

Nuclease Prime Editorは、Cas9(H840A)ニッカーゼの代わりにCas9ヌクレアーゼを使用します。効率的なプライム編集を誘導するために両方のDNA鎖に二重のニックを必要とするプライムエディター3 (PE3)とは異なり、Nuclease Prime Editorは単一のgRNAで既に一本鎖のニックではなく二本鎖の切断が作成されているため、単一のpegRNAのみを必要とします。^[10]

2021年に報告された「ツインプライム編集」（twinPE）メカニズムは、遺伝子と同じくらいの大きさのDNA配列の編集を可能にし、この方法の主な欠点を解決します。プライムエディタータンパク質と2つのプライム編集ガイドRNAを使用します。^{[11] [12] [詳細が必要]}

プライム編集はブロード研究所のデイビッド・R・リューの研究室で開発され、アンザローネら（2019）で発表されました。^[13]それ以来、プライム編集とそれを生み出した研究は広く科学的評価を受けており、^{[14] [6] [15] 「革命的」 [7]}であり、編集の将来にとって重要な部分であると言われています。^[13]

プライム編集の効率は、人工ペグRNA（epegRNA）の使用によって高めることができます。従来のペグRNAの一般的な問題の1つは、3'末端の分解によりPE効率が低下することです。epegRNAは、分解を防ぐために3'末端に構造化されたRNAモチーフが追加されています。^[16]

プライム編集の効率を改善するにはさらなる研究が必要ですが、この技術は他の遺伝子編集ツールに比べて有望な科学的改善をもたらします。プライム編集技術は、挿入、欠失、ヌクレオチド置換を修復できるため、遺伝病を引き起こす病原性対立遺伝子の大部分を修正できる可能性があります。^[1]

プライム編集ツールは、従来の遺伝子編集技術に比べて利点がある。CRISPR /Cas9編集は、 DNA切断を修復するために非相同末端結合（NHEJ）または相同性誘導修復（HDR）に依存しているが、プライム編集システムはDNA不一致修復を採用している。NHEJやHDRなどのDNA修復メカニズムは、望ましくないランダムな挿入または削除（INDEL）を生成するため、これはこの技術の重要な特徴である。これらは、正しい編集を含む細胞の回収を複雑にする副産物である。^{[1] [17]}

プライムシステムは、塩基編集ツールなどの他の編集ツールで見られる二本鎖 DNA 切断ではなく、一本鎖 DNA 切断を導入します。 全体として、塩基編集とプライム編集は、標的のトランジション変異を作成するための補完的な長所と短所を提供します。 目的の編集がトランジションポイント変異であり、PAM 配列がターゲットサイトから約 15 塩基に存在する場合、塩基編集は編集効率が高く、INDEL 副産物が少なくなります。 ただし、プライム編集技術では、ヌクレオチド配列をターゲットにするために正確に配置された PAM 配列を必要としないため、柔軟性と編集精度が向上します。 注目すべきことに、プライムエディターでは、あらゆる種類の置換、トランジション、およびトランスバージョンをターゲット配列に挿入できます。^{[1] [17]} シトシン塩基編集とアデニン BE はすでに正確な塩基トランジションを実行できますが、塩基トランスバージョンについては適切なオプションがありませんでした。 プライム編集は、優れた使いやすさでトランスバージョンを実行します。 PE は、最大 44bp を挿入、最大 80 を削除、またはその組み合わせを実行できます。^[7]

プライムシステムには3つの別々のDNA結合イベント（（i）ガイド配列と標的DNAの間、（ii）プライマー結合部位と標的DNAの間、（iii）ニックDNA鎖の3'末端とペグRNAの間）が含まれるため、CRISPR/Cas9よりも望ましくないオフターゲット効果が少ないことが示唆されています。^{[1] [17]}

遺伝子編集法を遺伝的要素を持つ疾患の治療に応用することには大きな関心が寄せられている。しかし、このアプローチには多くの課題が伴う。効果的な治療には多数の標的細胞の編集が必要であり、それには効果的な送達方法と高いレベルの組織特異性が必要となる。^{[1] [18]}

2019年現在、プライム編集は比較的小さな遺伝子改変には有望に見えますが、標的挿入や削除などのより大きな改変を行うのにこの技術が効率的であるかどうかを評価するには、さらなる研究が必要です。より大きな遺伝子改変にはより長いRTテンプレートが必要となり、pegRNAを標的細胞に効率的に送達することが妨げられる可能性があります。さらに、長いRTテンプレートを含むpegRNAは、細胞酵素による損傷を受けやすくなる可能性があります。^{[1] [18]}植物におけるプライム編集は、0～数パーセントの低い効率に悩まされており、大幅な改善が必要です。^[19]

これらの制限のいくつかは、最近のプライムエディターの改良によって緩和されており、^{[2] [20]}ペグRNAを分解から保護するモチーフも含まれています。^[21]プライム編集をヒトの病原性対立遺伝子の修正に使用するには、さらなる研究が必要です。^{[1] [18]研究では、MLH1を含む特定の}MMRタンパク質を阻害すると、プライム編集の効率が向上することも示されています。^[9]

プライム編集に使用される塩基エディターは、タンパク質とRNA分子の両方を生きた細胞に送達する必要がある。生体に外因性の遺伝子編集技術を導入することは大きな課題である。動物や植物に塩基エディターを導入する可能性のある方法の1つは、塩基エディターをウイルスカプシドにパッケージ化することです。次に、標的生物にウイルスを導入して、生体内で塩基エディターを合成することができます。レンチウイルスなどの一般的な実験室での導入ベクターは、ヒトに免疫反応を引き起こすため、提案されているヒトの治療法は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を中心にしていることが多いです。AAV感染は大部分が無症状であるためです。残念ながら、AAVベクターの有効なパッケージング容量は小さく、逆方向末端反復を除いて約4.4kbです。^[22]比較すると、SpCas9逆転写酵素融合タンパク質は6.3kbであり、^{[1] [23]}これは、目的の部位を標的にしてプライミングするために必要な長いガイドRNAを考慮していません。しかし、マウスへの送達は、エディターを2つのAAVベクターに分割することによって^{[2] [3] [4] [24]}、またはより大きなパッケージング容量を持つアデノウイルス^[3]を使用することによって成功しました。

プライムエディターは遺伝子ドライブに使用できる。プライムエディターはCleave and Rescue / ClvRシステムのCleaver半分に組み込むことができる。この場合、正確な変更を実行するのではなく、単に混乱させることを目的としています。^[25]

PEは、一塩基多型（SNP）をある作物から別の作物に移すことを可能にする最近導入された技術の一つです。PEは、任意の標的に任意のSNPを再現するのに十分な精度を備えており、^{[14]欠失、挿入、および12の点変異すべてを含み、}二本鎖切断やドナーテンプレートの運搬を必要とせずに再現できます。 ^[6]