Cre-Lox組換え

Cre-lox組換えは、細胞のDNAの特定部位で欠失、挿入、転座、逆位を行うために用いられる部位特異的組換え酵素技術です。この技術により、DNA改変を特定の細胞型に標的化したり、特定の外部刺激によって誘発したりすることが可能になります。真核生物系と原核生物系の両方で利用されています。Cre-lox組換えシステムは、複雑な細胞型と神経回路が連携して認知や行動を生み出す脳の研究において、神経科学者にとって特に有用です。NIHの神経科学研究ブループリントでは、現在世界中の神経科学コミュニティで使用されている数百系統のCreドライバーマウス系統が作成されています。

Cre-loxシステムの重要な応用例の一つは、遺伝子置換における選択マーカーの除去である。一般的に用いられる遺伝子置換戦略では、成長阻害を引き起こす可能性のある遺伝子変異の選択を容易にするために、ゲノムに選択マーカーを導入する。しかし、マーカーの発現は、上流および下流の遺伝子の発現に極性効果をもたらす可能性がある。Cre-lox組換えによるゲノムからの選択マーカーの除去は、この問題を回避するための洗練された効率的な方法であり、そのため植物、マウス細胞株、酵母などで広く用いられている^{[ 1 ]。}

このシステムは、 Lox配列と呼ばれる一対の短い標的配列を組み換える単一の酵素、Creリコンビナーゼから構成されています。このシステムは、追加の補助タンパク質や配列を挿入することなく実装できます。Cre酵素と、LoxP配列と呼ばれる元のLox部位は、バクテリオファージP1に由来します。

Lox配列を適切に配置することで、遺伝子の活性化、抑制、または他の遺伝子との置換が可能になります。DNAレベルでは、様々な操作を行うことができます。Cre酵素の活性は、特定の細胞種で発現させたり、化学信号や熱ショックなどの外部刺激によって活性化させたりするように制御できます。このような標的を絞ったDNA改変は、細胞系統の追跡や、変異体が全身に発現すると致死となる場合に役立ちます。

Cre-Loxシステムは、その作用と使用法においてFLP-FRT組換えシステムと非常によく似ている。^{[ 2 ]}

Cre-Lox組換えは、ブライアン・サウアー博士によって開発され、デュポン社によって特許取得された特殊な部位特異的組換えであり、分裂中の有糸分裂細胞で機能し、当初は哺乳類細胞株での遺伝子発現の活性化に使用されました。 ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}その後、ジェイミー・マース 博士の研究室の研究者らは、Cre-Lox組換えが、トランスジェニック動物の特定の発生中のT細胞において、loxPで挟まれた染色体DNA配列を高効率で削除するために使用できることを実証し、このアプローチは、特定の細胞型における内因性遺伝子機能の定義、細胞運命決定研究における前駆細胞の不可逆的標識、生物学的および疾患モデル化のための特定の染色体再編成の誘導、および疾患（および表現型）維持における初期遺伝子病変の役割の決定に使用できると提案しました。^{[ 6 ]}

その後まもなく、クラウス・ラジェフスキー教授の研究室の研究者らは、標的化されたloxP配列で挟まれた（floxed）DNAポリメラーゼ遺伝子を持つ多能性胚性幹細胞の作製を報告した。^{[ 7 ]}これらの進歩を共同で組み合わせ、マース博士とラジェフスキー博士の研究室は1994年に、Cre-lox組換えが条件付き遺伝子ターゲティング に使用できることを報告した。^{[ 8 ]}彼らは、DNAブロッティングに基づいて、T細胞ではDNAポリメラーゼβ遺伝子の約50%が欠失していることを観察した。各T細胞で1つの対立遺伝子のみが欠失しているのか、T細胞の50%で両方の対立遺伝子が100%欠失しているのかは不明であった。その後、研究者らは、1995年にマース研究室によって、発達中のT細胞におけるCre-Lox条件付き遺伝子変異誘発の効率が向上したことを報告した。^{[ 9 ]} floxed配列のコピーが2つ存在する細胞では、 Creリコンビナーゼによる不完全な欠失は珍しくなく、キメラ組織の形成と研究を可能にする。マウスでテストされたすべての細胞型で、トランスジェニックCre組換えが起こることが示されている。しかし、DNA組換えは、教室で教えられ、生物学の教科書に書かれているように、分裂中の細胞でのみ起こるため、Cre-loxを介したDNA組換えが、分裂していない分裂後細胞で機能するかどうかは不明である。

MITのJoe Z. Tsienは、数百種類の異なるニューロンが存在する可能性があり、成体脳のほぼすべてのニューロンが分裂後であることが知られている成体脳において、細胞型および領域特異的な遺伝子操作にCre-loxPシステムを使用する先駆者となった。^{[ 10 ]} Tsienと彼の同僚は、成体マウス前脳の分裂後錐体ニューロンでCre媒介組換えが起こり得ることを実証した。^{[ 11 ]}

これらの発展により、条件付き突然変異誘発は生物医学研究で広く使用されるようになり、特定の細胞型や特定の発生時期における遺伝子機能を決定するための強力なプラットフォームとなる多くの分野に及んでいます。特に、脳研究において特定の細胞/回路と行動との複雑な関係を正確に定義する上でのその有用性が明確に実証されたことで、^{[ 12 ]} NIH は 2000 年初頭に NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre ドライバー マウス プロジェクトを開始しました。^{[ 13 ] [ 14 ]} 現在までに、NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre プロジェクトは、世界中の神経科学コミュニティで使用されている数百の Cre ドライバー マウス系統を作成しました。

Cre-Lox組換えは、特定のDNA配列を標的とし、 Creリコンビナーゼと呼ばれる酵素の助けを借りてそれをスプライシングする。Cre-Lox組換えは、多くの遺伝子の全身的な不活性化によって引き起こされる胚致死を回避するためによく使用される。^{[ 15 ] [ 16 ]} 2019年2月現在、Cre-Lox組換えは強力なツールであり、遺伝子型と表現型を関連付けるためにトランスジェニック動物モデルで使用されている。^{[ 12 ] [ 17 ] [ 18 ]}

Cre-loxシステムは、ゲノムDNAにおける部位特異的な組換えイベントを制御するための遺伝子ツールとして使用されています。このシステムにより、研究者はさまざまな遺伝子改変生物を操作して遺伝子発現を制御したり、不要なDNA配列を削除したり、染色体構造を改変したりすることが可能になりました。^{[ 19 ]}

Creタンパク質は、DNA分子内の特定の部位間でDNAの組換えを触媒できる部位特異的DNAリコンビナーゼである。これらの部位はloxP配列として知られており、組換えが起こる方向性のあるコア配列を取り囲むように、Creタンパク質の特異的な結合部位が存在する。

ゲノムにloxP部位を持つ細胞がCreを発現すると、 loxP部位間で組換えが起こる。Creリコンビナーゼタンパク質はlox部位の最初と最後の13 bp領域に結合して二量体を形成する。この二量体は別のlox部位の二量体と結合して四量体を形成する。lox部位は方向性があり、四量体によって結合された2つの部位は平行な向きになる。二本鎖DNAはCreタンパク質によって両方のloxP部位で切断される。その後、 DNAリガーゼによって鎖が迅速かつ効率的に再結合される。組換えの結果はloxP部位の向きによって決まる。同じ染色体腕上の2つのlox部位の場合、逆向きのloxP部位は介在​​するDNAの反転を引き起こし、loxP部位の直接反復は欠失を引き起こす。loxP部位が異なる染色体上にある場合、 Cre誘導組換えによって転座事象が触媒される可能性がある。2つのプラスミドは、変異lox部位71と66を使用して結合することができる。 ^{[ 20 ]}

遺伝子組換えの過程で、 DNAの2本の鎖の間にホリデー接合が形成され、DNA分子の二本鎖切断によって3'OH末端が露出します。この反応は、酵素のエンドヌクレアーゼ活性によって促進されます。通常、この反応の基質は5'リン酸末端であるため、3'領域が長く残ります。この3'OH基は非常に不安定であるため、それが存在する鎖は相補鎖を見つけなければなりません。相同組換えはDNA複製後に起こるため、2本のDNA鎖が存在し、したがって3'OH基は相補鎖と対合する必要があり、実際に、もう一方の二本鎖上の無傷の鎖と対合します。こうして、1つの交差点が生じ、これがホリデー中間体と呼ばれます。

3'OH末端はDNAポリメラーゼの働きによって伸長される（すなわち、塩基が付加される）。反対鎖同士の対合は、交差または組換えと呼ばれる現象であり、これはすべての生物に共通する。なぜなら、一方の二本鎖DNAの一方の鎖の遺伝物質が、もう一方の二本鎖DNAの一方の鎖と対合し、DNAポリメラーゼによって伸長されるからである。ホリデー中間体のさらなる切断によって、ハイブリッドDNAが形成される。

このさらなる切断、すなわち「分解」は、レゾルベーゼと呼ばれる特殊な酵素群によって行われます。RuvCは、細菌や酵母から単離されたレゾルベーゼの一つです。

長年にわたり、ホリデー接合中間体が形成されると、接合部の分岐点（鎖が交差する場所）が最初の切断部位に位置すると考えられていました。そして、分岐点が2番目の切断部位に移動することで、何らかの形で経路の後半が開始されると考えられていました。このモデルは、分岐移動がミスマッチで停止し、2番目の鎖交換が起こらないため、組換え部位間の相同性が厳密に要求されることを都合よく説明していました。しかし、近年ではこの見解は疑問視されており、Int、Xer、Flp組換えに関する現在のモデルのほとんどは、限定的な分岐移動（ホリデー中間体の1～3塩基対）と、鎖切断特異性を切り替える異性化イベントのみを伴います。

部位特異的組換え（SSR）は、リコンビナーゼと呼ばれる特殊な酵素の触媒作用を受ける特定の部位を介する。Cre（環状リコンビナーゼ）はそのような酵素の一つである。したがって、部位特異的組換えとは、酵素によって媒介される、2つの特定のデオキシヌクレオチド配列の切断と連結のことである。

原核生物と真核生物の両方において、保存された部位特異的組換えシステムが数多く報告されている。一般的に、これらのシステムは1つ以上のタンパク質を使用し、特異的な非対称DNA配列に作用する。組換え反応の産物は、これらの非対称配列の相対的な向きによって決まる。組換え酵素以外にも、多くのタンパク質が反応の調節に関与している。ウイルスの組み込みと切除、染色体分離などの過程で遺伝子再編成をもたらす部位特異的DNA組換えにおいて、これらの組換え酵素は特定のDNA配列を認識し、これらの部位間でDNA鎖の相互交換を触媒する。

作用機序

部位特異的組換えの開始は、組換えタンパク質がそれぞれのDNA標的に結合することから始まります。別々の組換え酵素が、2つの異なるDNA分子上、または同じDNA鎖内の2つの組換え部位をそれぞれ認識して結合します。DNA上の特定の部位において、組換え酵素中のチロシンのヒドロキシル基が、直接的なトランスエステル化機構を用いてDNA骨格中のリン酸基を攻撃します。この反応により、組換え酵素タンパク質はリン酸チロシン結合を介してDNAに結合します。これにより、ホスホジエステル結合のエネルギーが保存され、高エネルギー補因子を必要とせずに反応を逆転させることができます。

もう一方の鎖の切断によっても、DNAと酵素の間にリン酸チロシン結合が形成される。両方のDNA二重らせんにおいて、リン酸基がチロシン残基に結合することで、DNA骨格内に3'OH基が遊離する。実際、酵素-DNA複合体は中間段階であり、その後、一方のDNA鎖の3'OH基が、チロシン残基に共有結合しているもう一方のDNA鎖の5'リン酸基に連結する。つまり、5'末端とチロシン残基間の共有結合が切断される。この反応によって、先に述べたホリデージョンクションが合成される。

このようにして、反対方向のDNA鎖が結合する。その後の切断と再結合によって、DNA鎖はそれぞれのセグメントを交換する。タンパク質間の相互作用が鎖交換を促進し、方向付ける。切断時に失われたホスホジエステル結合をタンパク質とDNAの結合が補うため、エネルギー損失は生じない。

部位特異的組換えは、バクテリオファージなどのウイルスが感染宿主に遺伝物質を組み込むために用いる重要なプロセスでもある。このような状態のウイルスはプロファージと呼ばれ、組み込みと切除によってこれを実現する。組み込みと切除反応が起こる部位は、付着（att）部位と呼ばれる。ファージ上のattP部位は、細菌DNA上のattB部位とセグメントを交換する。したがって、これらは部位特異的であり、それぞれのatt部位でのみ起こる。インテグラーゼと呼ばれる酵素群がこの特定の反応を触媒する。

P1ファージは、細菌に感染すると溶原サイクルまたは溶菌サイクルを引き起こす温和性ファージです。溶菌状態では、ウイルスゲノムが宿主細​​胞に注入されると、ウイルス蛋白質が産生され、ビリオンが組み立てられ、宿主細胞が溶解してファージが放出され、サイクルが継続します。溶原サイクルでは、ファージゲノムは細菌ゲノムの残りの部分とともに複製され、その後の細胞分裂ごとに娘細胞に伝達されます。紫外線照射や飢餓などの後続の事象によって溶菌サイクルに移行することもあります。

ラムダファージのようなファージは、溶原化の際に部位特異的組換え酵素を用いてDNAを宿主ゲノムに組み込む。一方、P1ファージDNAは宿主内でプラスミドとして存在する。Cre-loxシステムはファージ内でいくつかの機能を果たしている。ファージDNAを環状化してプラスミドにし、連結したプラスミド環を分離して両方の娘細菌に均等に渡るようにし、複製の代替手段によってコピー数を維持するのに役立つ可能性がある。^{[ 40 ]}

P1ファージDNAは、ビリオンから宿主細胞内に放出されると、線状の二本鎖DNA分子の形をとる。Cre酵素はこの分子の両端にあるloxP部位を標的とし、ゲノムを環状化する。これは、Cre loxシステムが存在しない場合でも、他の細菌タンパク質やウイルスタンパク質の助けを借りて起こる可能性がある^{[ 41 ]}。P1プラスミドは比較的大きく（約90Kbp）、そのためコピー数は少なく、通常は細胞あたり1つしか存在しない。2つの娘プラスミドが相互に連結すると、宿主の娘細胞のうち1つがプラスミドを失う。Cre-lox組換えシステムは、2つの組換えイベント（連結した環状DNA → 1つの融合した環状DNA → 2つの連結していない環状DNA）を実行することでDNAの環状DNAを分離し、このような状況を防ぐ。また、特定の調節因子（repA）が制限されている場合、ローリングサークル複製とその後の組換えによってプラスミドのコピー数を増やすことができると提案されている^{[ 40 ] 。}

遺伝子欠失変異体を生成する古典的な戦略は、非複製ベクターのゲノムへの二重交差組み込みに基づいています。さらに、Cre-loxなどの組換えシステムは、主に真核生物で広く使用されています。Creリコンビナーゼの多用途な特性により、多くの遺伝子工学戦略での使用に理想的です。そのため、Cre-loxシステムは、植物を含むさまざまな真核生物で使用されています。^{[ 42 ]}

loxPの複数の変異体^{[ 43 ]}、特にlox2272とloxNは、異なるCre作用（一過性または構成的）の組み合わせで研究者によって使用され、4つの蛍光タンパク質でマウスの脳を多色化できる「 Brainbow 」システムが作成されました。

別の報告では、2つのloxバリアントペアを使用するが、一方のペアのDNAの長さを調節することで、スパースネスのレベルを調節した確率的遺伝子活性化が起こる。^{[ 28 ]}

• 「ジャクソン研究所」によるCre-lox技術の紹介（ 2009年10月9日にWayback Machineにアーカイブ済み）