遺伝子工学技術

遺伝子工学技術により、動物や植物のゲノムを改変することができます。特定の遺伝子の特定の塩基対から遺伝子全体に至るまで、さまざまなレベルでDNA を挿入、削除、改変する技術が考案されています。遺伝子組み換え生物(GMO) が作られるまでには、いくつかの手順があります。遺伝子工学者は、まず、挿入、改変、または削除したい遺伝子を選択する必要があります。次に、遺伝子を分離し、他の遺伝要素とともに適切なベクターに組み込む必要があります。次に、このベクターを使用して遺伝子を宿主ゲノムに挿入し、トランスジェニック生物または編集された生物を作成します。

生物の遺伝子操作能力は、遺伝子の機能と操作に関する長年の研究と発見の上に築かれました。重要な進歩には、制限酵素、DNAリガーゼの発見、ポリメラーゼ連鎖反応と配列決定の開発が含まれます。

追加された遺伝子には、プロモーター領域とターミネーター領域、および選択マーカー遺伝子が付随することがよくあります。追加された遺伝子自体を改変して、より効率的に発現させることもできます。その後、このベクターは宿主生物のゲノムに挿入されます。動物の場合、遺伝子は通常、胚性幹細胞に挿入されますが、植物の場合は、完全に成長した植物に培養できる任意の組織に挿入できます。

組み換えられた生物に対しては、安定した統合、継承、および発現を保証するための試験が行われます。第一世代の子孫はヘテロ接合性であるため、安定した継承に必要なホモ接合パターンを作成するには、近親交配を行う必要があります。第二世代の標本ではホモ接合性を確認する必要があります。

初期の技術では、遺伝子をゲノムにランダムに挿入していました。技術の進歩により、特定の場所をターゲットにできるようになり、意図しない副作用が減りました。初期の技術では、メガヌクレアーゼとジンクフィンガーヌクレアーゼが利用されていました。2009年以降、より正確で実装しやすいシステムが開発されました。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）とCas9ガイドRNAシステム（ CRISPRから改良）の2つが最も一般的です。

遺伝子工学の発展は、さまざまな発見と進歩によってもたらされました。人間による遺伝子操作は、紀元前12,000年頃の人工選択による植物や動物の家畜化から始まりました。 ^{[1] : 1}繁殖と選択を支援するために、さまざまな技術が開発されました。交配は、生物の遺伝子構成に急速な変化をもたらす方法の1つでした。作物の交配は、人間が近縁種の遺伝的に異なる個体を近くで育て始めたときに初めて発生したと考えられます。^{[2] : 32}一部の植物は、栄養クローンによって繁殖することができました。^{[2] : 31}

遺伝的継承は、1865年にグレゴール・メンデルがエンドウ豆の交配実験の後に初めて発見されました。 ^[3] 1928年にフレデリック・グリフィスは、 遺伝に関与する「変換原理」の存在を証明し、1944年にオズワルド・エイブリー、コリン・マクラウド、マクリン・マッカーティによってDNAであると特定されました。フレデリック・サンガーは1977年にDNAの配列を決定する方法を開発し、研究者が利用できる遺伝情報を大幅に増加させました。

DNAの存在と特性が発見された後、それを操作できるツールを開発する必要がありました。1970年にハミルトン・スミスの研究室は制限酵素を発見し、科学者は生物のゲノムから遺伝子を分離できるようになりました。 ^{[4]壊れたDNAを結合する} DNAリガーゼは、1967年に発見されました。^[5] 2つの酵素を組み合わせることで、DNA配列を「カットアンドペースト」して組み換えDNAを作成することができました。 1952年に発見されたプラスミド^[6]は、細胞間で情報を転送し、 DNA配列を複製するための重要なツールになりました。 1983年にキャリー・マリスが開発したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、DNAの小さなセクションを増幅（複製）できるようになり、遺伝物質の識別と分離に役立ちました。

DNAを操作するだけでなく、生物のゲノムにDNAを挿入する技術も開発する必要があった。グリフィスの実験では、一部の細菌が外来DNAを自然に取り込み、発現する能力を持っていることがすでに示されていた。1970年には、大腸菌を塩化カルシウム溶液（CaCl ₂）で処理することで人工的にコンピテンスを誘導した。^[7]電気穿孔法による形質転換は1980年代後半に開発され、効率と細菌の範囲が拡大した。^[8] 1907年には、植物の腫瘍を引き起こす細菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが発見された。1970年代初頭には、この細菌がTiプラスミドを使用して植物にDNAを挿入することが判明した。^[9]腫瘍を引き起こすプラスミドの遺伝子を除去し、新しい遺伝子を追加することで、研究者は植物にA.ツメファシエンスを感染させ、細菌が選択したDNAを植物のゲノムに挿入できるようにした。^[10]

最初のステップは、宿主生物に挿入する標的遺伝子を特定することです。これは、結果として生じる生物の目標によって決まります。場合によっては、1つまたは2つの遺伝子のみが影響を受けます。より複雑な目的の場合、複数の遺伝子を含む生合成経路全体が関与することがあります。さまざまな生物から遺伝子やその他の遺伝情報が見つかったら、それを細菌に挿入して保存および改変し、その過程で遺伝子改変細菌を作成することができます。細菌は安価で、増殖しやすく、クローン化されており、急速に増殖し、比較的簡単に形質転換でき、-80°Cでほぼ無期限に保存できます。遺伝子が分離されると、細菌内に保存できるため、研究用に無制限に供給できます。^[11]

遺伝子スクリーニングを実施して潜在的な遺伝子を特定し、その後に他の検査を行って最適な候補遺伝子を特定することができます。単純なスクリーニングでは、化学物質や放射線で DNA をランダムに変異させ、目的の特性を示す遺伝子を選択します。変異が現実的でない生物の場合、科学者は代わりに、集団内で自然に発生する変異を通じて特性を示す個体を探します。表現型を調べ、原因となる遺伝子を特定しようとするプロセスは、順方向遺伝学と呼ばれます。次に、表現型の遺伝を既知の遺伝子マーカーと比較することにより、遺伝子をマッピングする必要があります。互いに近い遺伝子は、一緒に遺伝する可能性が高いです。^[12]

もう一つの選択肢は、逆遺伝学です。このアプローチでは、特定の遺伝子を標的にして突然変異を起こし、どのような表現型が現れるかを観察します。^[12]突然変異は、遺伝子を不活性化するように設計することも、特定の条件下でのみ遺伝子が活性化するように設計することもできます。条件付き突然変異は、機能しない場合は通常致死的な遺伝子を特定するのに役立ちます。^[13]同様の機能を持つ遺伝子は同様の配列（相同性）を共有するため、モデル生物から得られたよく研究された遺伝子の配列と比較することで、遺伝子の可能性のある機能を予測することができます。^[12]マイクロアレイ、トランスクリプトーム、ゲノム配列決定の開発により、望ましい遺伝子を見つけることがはるかに容易になりました。^[14]

バチルス・チューリンゲンシス菌は、 1901年にカイコの死因物質として初めて発見されました。この菌は殺虫特性があるため、生物学的殺虫剤として使用され、1938年に商業的に開発されました。cryタンパク質が殺虫活性をもたらすことが1956年に発見され、1980年代までに科学者はこのタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、植物で発現させることに成功しました。^[15] 除草剤グリホサートに対する耐性をもたらす遺伝子は、モンサント社の ラウンドアップ製造施設の排水管に生息する細菌で7年間の探索の末に発見されました。 ^[16]動物では、使用される遺伝子の大部分は成長ホルモン遺伝子です。^[17]

すべての遺伝子工学プロセスには DNA の改変が伴います。伝統的に DNA は生物の細胞から分離されていました。その後、遺伝子はDNA ライブラリの作成後に DNA セグメントからクローン化されるか、人工的に合成されるようになりました。いったん分離されると、遺伝子にさらなる遺伝子要素が追加され、宿主生物内で発現し、選択を補助できるようになります。

まず、細胞をそっと開き、DNA を露出させますが、あまり損傷を与えないようにする必要があります。方法は細胞の種類によって異なります。細胞が開いたら、DNA を他の細胞成分から分離する必要があります。破裂した細胞にはタンパク質やその他の細胞破片が含まれています。フェノールやクロロホルムと混合し、遠心分離することで、核酸を破片から上部の水相に分離できます。この水相は、フェノール-クロロホルムの手順を繰り返すことで除去し、さらに精製することができます。その後、エタノールまたはイソプロパノールを使用して核酸を水溶液から沈殿させることができます。RNAは、それを分解するリボヌクレアーゼを追加することで除去できます。現在、多くの企業がこのプロセスを簡素化するキットを販売しています。 ^[18]

研究者が改変しようとしている遺伝子（目的遺伝子と呼ばれる）は、抽出した DNA から分離する必要があります。配列が不明な場合、一般的な方法は、ランダム消化法で DNA を分割することです。これは通常、制限酵素（DNA を切断する酵素）を使用して行われます。部分的な制限消化では、制限部位の一部のみが切断されるため、重複した DNA 断片セグメントが生じます。DNA 断片は個別のプラスミドベクターに入れられ、細菌内で増殖します。細菌内に入ると、細菌が分裂するにつれてプラスミドがコピーされます。特定の断片に有用な遺伝子が存在するかどうかを判断するために、DNA ライブラリをスクリーニングして、目的の表現型を調べます。表現型が検出された場合、細菌に目的の遺伝子が含まれている可能性があります。

遺伝子に検出可能な表現型がない場合、または DNA ライブラリに正しい遺伝子が含まれていない場合は、他の方法を使用して遺伝子を分離する必要があります。分子マーカーを使用して遺伝子の位置を決定できる場合は、染色体ウォーキングが正しい DNA フラグメントを分離する 1 つの方法です。遺伝子が別の種の既知の遺伝子と高い相同性を示す場合は、ライブラリ内で既知の遺伝子とよく一致する遺伝子を検索することで遺伝子を分離できます。^[19]

既知のDNA配列の場合、遺伝子の両側でDNAを切断する制限酵素を使用することができる。次に、ゲル電気泳動により長さに応じて断片を分類する。 ^[20]一部のゲルは、1塩基対だけ異なる配列を分離できる。DNAは、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で撮影することで視覚化できる。既知の長さの断片の付いたマーカーをDNAの横に置くと、各バンドのサイズを推定することができる。正しいサイズのDNAバンドに遺伝子が含まれているはずなので、ゲルから切り取ることができる。^{[18] : 40–41}既知の配列の遺伝子を分離する別の技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。^[21] PCRは、特定の配列を増幅できる強力なツールであり、ゲル電気泳動で分離することができる。その有効性は遺伝子が大きいほど低下し、配列にエラーを導入する可能性がある。

遺伝子を人工的に合成することは可能です。^[22]いくつかの合成配列は市販されており、これらの初期段階の多くを省略できます。^[23]

挿入される遺伝子は、適切に機能するためには他の遺伝子要素と組み合わせる必要がある。遺伝子はこの段階で改変され、より良い発現や効果が得られる。挿入される遺伝子に加え、ほとんどのコンストラクトにはプロモーターとターミネーター領域、および選択マーカー遺伝子が含まれている。プロモーター領域は遺伝子の転写を開始し、遺伝子発現の位置とレベルを制御するために使用できるが、ターミネーター領域は転写を終了させる。選択マーカーは、ほとんどの場合、それが発現する生物に抗生物質耐性を付与し、どの細胞が新しい遺伝子で形質転換されるかを決定するために使用される。コンストラクトは、制限消化、ライゲーション、分子クローニングなどの組換えDNA技術を使用して作成される。^[24]

遺伝子が構築されると、それは標的生物のゲノムに安定的に組み込まれるか、染色体外DNAとして存在する必要があります。遺伝子を宿主ゲノムに挿入するための技術はいくつかあり、標的生物の種類によって異なります。多細胞真核生物では、トランスジーンが宿主の生殖細胞に組み込まれると、結果として生じた宿主細胞はトランスジーンを子孫に渡すことができます。トランスジーンが体細胞に組み込まれると、トランスジーンは継承されません。^[25]

形質転換とは、遺伝物質を細胞膜に通過させることによって細胞の遺伝成分を直接変更することです。約 1% の細菌は自然に外来 DNA を取り込むことができますが、この能力は他の細菌でも誘導することができます。^[26]熱ショックまたは電気穿孔法で細菌にストレスを与えると、細胞膜がDNA に対して透過性になり、ゲノムに組み込まれるか、染色体外 DNA として存在する可能性があります。通常、細胞は冷条件下で二価 カチオン(多くの場合、塩化カルシウム) を含む溶液中で培養され、その後熱パルス (熱ショック) にさらされます。塩化カルシウムは細胞膜​​を部分的に破壊し、これにより組み換え DNA が宿主細胞に侵入できるようになります。冷条件下で細胞を二価カチオンにさらすと、細胞表面構造が変化または弱まり、DNA の透過性が高まることが示唆されています。熱パルスは細胞膜全体の熱不均衡を生み出し、DNA が細胞孔または損傷した細胞壁のいずれかから細胞内に侵入すると考えられています。電気穿孔法は、コンピテンスを促進するもう 1 つの方法です。この方法では、細胞に10～20 kV /cmの電界を短時間かけてショックを与え、細胞膜に穴を開けてプラスミド DNA が侵入できるようにすると考えられています。電気ショックの後、穴は細胞の膜修復機構によって急速に閉じられます。取り込まれた DNA は、細菌のゲノムに組み込まれるか、より一般的には染色体外 DNAとして存在します。

植物では、DNAはアグロバクテリウム媒介組換え^[27]を使用して挿入されることが多く、アグロバクテリウムのT-DNA配列を利用して遺伝物質を植物細胞に自然に挿入します。^{[28]植物組織を細かく切断し、}アグロバクテリウムを懸濁した液体に浸します。細菌は切り口で露出した植物細胞の多くに付着します。細菌は接合を利用して、 T-DNAと呼ばれるDNAセグメントをプラスミドから植物に移します。移されたDNAは植物細胞核に導かれ、宿主植物のゲノムDNAに組み込まれます。プラスミドT-DNAは、宿主細胞のゲノムに半ランダムに組み込まれます。^[29]

目的の遺伝子を発現するようにプラスミドを改変することで、研究者は選択した遺伝子を植物ゲノムに安定的に挿入することができます。T-DNAの唯一の必須部分は、2つの小さな（25塩基対）境界反復であり、少なくともそのうちの1つは植物の形質転換に必要です。^{[30] [31]}植物に導入される遺伝子は、プラスミドのT-DNA領域を含む植物形質転換ベクターにクローン化されます。別の方法は、アグロインフィルトレーションです。^{[32] [33]}

植物細胞の形質転換に使用される別の方法はバイオリスティックスであり、金またはタングステンの粒子をDNAでコーティングし、若い植物細胞または植物胚に注入する。^[34]一部の遺伝物質が細胞に入り込み、細胞を形質転換する。この方法は、アグロバクテリウム感染の影響を受けない植物に使用することができ、植物のプラスチドの形質転換も可能になる。植物細胞は、電気穿孔法を使用して形質転換することもできる。これは、電気ショックを使用して細胞膜をプラスミドDNAに対して透過可能にする。細胞とDNAに損傷を与えるため、バイオリスティックスと電気穿孔法の形質転換効率は、アグロバクテリウムによる形質転換よりも低い。^[要出典]

形質転換は動物に関しては意味が異なり、癌状態への進行を示すため、動物細胞に外来DNAを挿入するプロセスは通常、トランスフェクションと呼ばれます。 ^[35]試験管内で動物細胞にDNAを直接導入する方法は多数あります。多くの場合、これらの細胞は遺伝子治療に使用される幹細胞です。化学ベースの方法では、天然または合成化合物を使用して、細胞への遺伝子の導入を促進する粒子を形成します。^[36]これらの合成ベクターは、DNAに結合し、大量の遺伝子導入に対応する能力があります。^[37]最も簡単な方法の1つは、リン酸カルシウムを使用して DNAを結合し、それを培養細胞にさらすことです。溶液は、DNAとともに細胞にカプセル化されます。 ^[38]リポソームとポリマーは、培養された動物細胞にDNAを送達するためのベクターとして使用できます。正に帯電したリポソームはDNAと結合し、ポリマーはDNAと相互作用するように設計できます。^[36]これらはそれぞれリポプレックスとポリプレックスを形成し、細胞に取り込まれます。他の技術としては、電気穿孔法やバイオリスティック法などがあります。^[39]場合によっては、トランスフェクトされた細胞が外部DNAを自身のゲノムに安定的に組み込むことがあり、このプロセスは安定トランスフェクションとして知られています。^[40]

トランスジェニック動物を作るには、DNAを生存可能な胚または卵子に挿入する必要があります。これは通常、マイクロインジェクションを使用して行われます。マイクロインジェクションでは、DNAが細胞の核膜を通して核に直接注入されます。^[26] 過剰排卵された受精卵は単一細胞段階で収集され、in vitroで培養されます。精子の頭部と卵子の前核が原形質を通して見えるようになったら、遺伝物質をそのうちの1つに注入します。次に、卵母細胞を偽妊娠動物の卵管に移植します。^[41]別の方法は、胚性幹細胞を介した遺伝子移入です。遺伝子は胚性幹細胞にトランスフェクトされ、次にマウスの胚盤胞に挿入され、その後、里親に移植されます。結果として生じる子孫はキメラであり、さらに交配すると、目的の遺伝子で完全にトランスジェニックなマウスを作成できます。^[42]

形質導入は、外来DNAがウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入されるプロセスである。^{[43]遺伝子組み換えウイルスは、}遺伝子治療において標的遺伝子を別の生物に移すためのウイルスベクターとして使用することができる。^[44]まず、毒性遺伝子がウイルスから除去され、代わりに標的遺伝子が挿入される。ウイルスが遺伝子を宿主生物に挿入できるようにする配列は、そのまま残されていなければならない。一般的なウイルスベクターは、レトロウイルスまたはアデノウイルスから開発されている。ベクターとして使用される他のウイルスには、レンチウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスなどがある。使用するウイルスの種類は、標的となる細胞と、DNAが永久的に変更されるか一時的に変更されるかによって決まる。

多くの場合、遺伝物質で形質転換されるのは単一の細胞だけなので、その単一の細胞から生物を再生する必要があります。植物では、これは組織培養を使用して行われます。^{[45] [46]}植物種ごとに、再生を成功させるための要件が​​異なります。再生が成功すれば、この技術により、すべての細胞に導入遺伝子を含む成体植物が生成されます。 ^{[47]動物では、挿入されたDNAが}胚性幹細胞に存在することを確認する必要があります。^[27]子孫は遺伝子についてスクリーニングすることができます。第1世代のすべての子孫は、挿入された遺伝子についてヘテロ接合性であり、ホモ接合性の標本を生成するには近親交配する必要があります。^[要出典]細菌は単一の細胞で構成され、クローンとして再生するため、再生は必要ありません。選択マーカーを使用すると、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞を簡単に区別できます。

DNA でうまく形質転換された細胞にはマーカー遺伝子が含まれるが、形質転換されなかった細胞には含まれない。その遺伝子を発現する細胞を選択またはマークする抗生物質または化学物質の存在下で細胞を培養することにより、改変された細胞と改変されていない細胞を分離することができる。別のスクリーニング法では、挿入された遺伝子にのみ付着するDNA プローブを使用する。これらのマーカーは通常、トランスジェニック生物に存在するが、成熟したトランスジェニック植物から選択マーカーを除去できるいくつかの戦略が開発されている。^[48]

組み換え生物に挿入された遺伝子が含まれていることがわかっただけでは、通常、意図した組織で適切に発現されることを保証するのに十分ではありません。PCR、サザンハイブリダイゼーション、DNA配列決定を使用した追加のテストが、生物に新しい遺伝子が含まれていることを確認するために行われます。^[49]これらのテストでは、挿入された遺伝子の染色体位置とコピー数も確認できます。確認されたら、遺伝子産物（RNAとタンパク質）を探して測定する方法も、遺伝子発現、転写、RNA処理パターン、タンパク質産物の発現と局在を評価するために使用されます。これらには、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的RT-PCR、ウエスタンブロット、免疫蛍光、ELISA、表現型分析が含まれます。^{[50]適切な場合は、生物の子孫を研究して、導入遺伝子と関連する}表現型が安定して継承されることを確認します。

遺伝子工学の従来の方法では、一般的に新しい遺伝物質を宿主ゲノム内にランダムに挿入します。これにより、生物内の他の遺伝子が損傷または変更される可能性があります。生物ゲノム内の特定の場所に新しい遺伝物質を挿入する方法が開発されました。ゲノム内の特定の場所の遺伝子をターゲットにした初期の方法は、相同組換え(HR) に依存していました。^[51]ターゲットゲノム配列に一致するテンプレートを含む DNA 構造を作成することにより、細胞内の HR プロセスによって構造が目的の場所に挿入される可能性があります。この方法を胚性幹細胞に使用することで、ターゲットをノックアウトしたトランスジェニックマウスが開発されました。遺伝子をノックインしたり、遺伝子発現パターンを変更したりすることも可能になりました。 ^[52]

重要な遺伝子がノックアウトされると、生物にとって致命的となる可能性がある。これらの遺伝子の機能を研究するために、部位特異的リコンビナーゼ（SSR）が使用された。最も一般的な2つのタイプは、Cre-LoxPシステムとFlp-FRTシステムである。Creリコンビナーゼは、 Lox-P部位として知られる結合配列間の相同組換えによってDNAを除去する酵素である。Flip-FRTシステムは同様に機能し、FlipリコンビナーゼはFRT配列を認識する。目的の遺伝子の両側にリコンビナーゼ部位を含む生物と、組織特異的プロモーターの制御下でSSRを発現する生物を交配することにより、特定の細胞でのみ遺伝子をノックアウトまたはオンにすることができる。これは、トランスジェニック動物からマーカー遺伝子を除去するためにも使用されている。これらのシステムをさらに改変することで、研究者は特定の条件下でのみ組換えを誘発し、遺伝子を所望の時期または発達段階でノックアウトまたは発現させることができるようになった。^[52]

ゲノム編集では、人工的に操作されたヌクレアーゼを使用して、 ゲノム内の目的の場所に特定の二本鎖切断を作成します。切断は細胞DNA 修復プロセスの対象となり、これを標的遺伝子のノックアウト、修正、または挿入に高頻度で利用できます。適切な配列 (相同性) を含むドナー DNA が存在する場合、トランスジーンを含む新しい遺伝物質が相同組み換えによって標的部位に高効率で組み込まれます。^[53]人工ヌクレアーゼには4つのファミリーがある：メガヌクレアーゼ、^{[54] [55]} ZFN、^{[56] [57]} 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、^{[58] [59]} CRISPR/Cas（クラスター化規則的間隔の短い回文反復配列/CRISPR関連タンパク質（例：CRISPR/Cas9））。^{[60] [61]} 4つのタイプのうち、TALENとCRISPR/Casの2つが最も一般的に使用されている。^[62]最近の進歩では、複数のシステムを組み合わせて両方の最良の機能を活用することが検討されている（例：TALE DNA結合ドメインとメガヌクレアーゼの融合であるメガTAL）。^[63]最近の研究では、二本鎖切断を起こさずに遺伝子ノックアウトまたは修正を作成する戦略（塩基エディター）の開発にも焦点が当てられている。^[62]

メガヌクレアーゼは1988年に哺乳類細胞で初めて使用されました。^[64]メガヌクレアーゼは長い認識部位を持つ制限酵素として機能するエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、他の制限酵素よりも標的部位に特異性があります。これにより特異性が向上し、ゲノム内の多くの部位を標的としないため毒性が低下します。最も研究されているメガヌクレアーゼはLAGLIDADGファミリーです。メガヌクレアーゼはオフターゲット結合の影響をまだかなり受けやすく、他の遺伝子編集ツールほど魅力的ではありませんが、サイズが小さいため、特にウイルスベクター化の観点からは魅力的です。^{[65] [53]}

1996年に初めて使用されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、通常、ジンクフィンガードメインとFok Iヌクレアーゼドメインの融合によって作成されます。したがって、ZFNは標的部位でDNAを切断する能力を持っています。^{[53]ジンクフィンガードメインをゲノム内の特定の部位を標的とするように設計することにより、目的の}位置でゲノム配列を編集することができます。^{[65] [66] [53]} ZFNはより高い特異性を持っていますが、非特異的な配列に結合する可能性を依然として持っています。ある程度のオフターゲット切断は、トランスジェニックモデル生物を作成するために許容されますが、すべてのヒト遺伝子治療治療に最適であるとは限りません。^[65]

2009年に転写活性化因子様エフェクター（TALE）によるDNA認識を制御するコードへのアクセスにより、新しいクラスの効率的なTALベースの遺伝子編集ツールの開発への道が開かれました。TALEは、キサントモナス植物病原体によって分泌されるタンパク質で、植物宿主内の遺伝子に非常に特異的に結合し、 感染を助ける遺伝子の転写を開始します。DNA結合コアをFok Iヌクレアーゼ触媒ドメインに融合させることでTALEをエンジニアリングすることで、デザイナーヌクレアーゼの新しいツールであるTALEヌクレアーゼ（TALEN）を作成することができました。^{[67]これらは、現在エンジニアリングされているすべてのヌクレアーゼの中で最も優れた特異性を持っています。反復配列が存在するため、標準的な分子生物学の手順で構築するのは難しく、}ゴールデンゲートクローニングなどのより複雑な方法に依存しています。^[62]

2011 年には、細菌や古細菌で適応免疫システムとして機能する CRISPR/Cas (クラスター化規則的間隔の短い回文反復配列 / CRISPR 関連タンパク質) システムに基づく、もう 1 つの大きなブレークスルー技術が開発されました。CRISPR/Cas システムにより、細菌や古細菌はウイルス DNA を切断し、その DNA の一部を自身のゲノムに挿入することで、侵入するウイルスと戦うことができます。次に、生物はこの DNA をRNAに転写し、この RNA をCas9タンパク質と組み合わせて、侵入したウイルス DNA で二本鎖切断を行います。RNA はガイド RNA として機能し、Cas9 酵素をウイルス DNA 内の正しい場所に導きます。Cas タンパク質を設計されたガイド RNA とペアリングすることで、CRISPR/Cas9 を使用して DNA 配列内の特定のポイントで二本鎖切断を誘発できます。切断は細胞の DNA 修復酵素によって修復され、ほとんどの場合、小さな挿入/削除タイプの変異が作成されます。標的DNA修復は、望ましい変化を表すドナーDNAテンプレートを提供することで可能となり、相同組み換えによる二本鎖切断修復に（時には）使用される。後に、CRISPR/Cas9は皿の中のヒト細胞を編集できることが実証された。初期世代はTALENほどの特異性はないが、この技術の主な利点は設計がシンプルであることだ。また、複数の部位を同時に標的とすることができるため、複数の遺伝子を一度に編集することができる。CRISPR /Cpf1は、最近発見されたシステムで、CRISPR/Cas9と比較すると、特定の二本鎖切断（DNAを切断する際にオーバーハングを残す）を作成するために異なるガイドRNAを必要とする。^[62]

CRISPR/Cas9 は遺伝子破壊に効果的です。中国の研究者 He Jiankui による HIV 耐性の赤ちゃんの誕生は、おそらくこの方法を使用した遺伝子破壊の最も有名な例です。^[68]遺伝子修正でははるかに効果がありません。塩基編集の方法が開発中です。これは、「ヌクレアーゼ不活性」Cas 9 エンドヌクレアーゼまたは関連酵素を遺伝子ターゲティングに使用し、リンクされたデアミナーゼ酵素が DNA のターゲット塩基変更を行う方法です。^[69] CRISPR-Cas9 の最新の改良はプライム編集と呼ばれています。この方法は、逆転写酵素を RNA 誘導工学ヌクレアーゼにリンクし、一本鎖切断のみを行い、二本鎖切断は行いません。ヌクレアーゼと逆転写酵素の連続的な作用により、切断箇所に隣接する DNA 部分を置き換え、RNA テンプレートから目的の変更を導入します。^[70]

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