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| Creリコンビナーゼ | |||||||
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.png/500px-CreRecImage(DNASUBSTRATE).png) 基質DNAに結合したCreリコンビナーゼ酵素（二量体）の構造 | |||||||
| 識別子 | |||||||
| 生物 | |||||||
| シンボル | クリ | ||||||
| エントレズ | 2777477 | ||||||
| RefSeq (Prot) | YP_006472.1 | ||||||
| ユニプロット | P06956 | ||||||
| その他のデータ | |||||||
| EC番号 | 2.7.7.- | ||||||
| 染色体 | ゲノム: 0 - 0 Mb | ||||||
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Cre リコンビナーゼは、 P1 バクテリオファージ由来のチロシン リコンビナーゼ酵素です。この酵素は、トポイソメラーゼ Iのようなメカニズムを使用して、部位特異的な組み換えイベントを実行します。この酵素 (38 kDa) は、部位特異的な組み換え酵素のインテグラーゼファミリーのメンバーであり、2 つの DNA 認識部位 ( LoxP 部位) 間の部位特異的な組み換えイベントを触媒することが知られています。この 34 塩基対 (bp) の loxP 認識部位は、8 bp のスペーサー領域を挟んだ 2 つの 13 bp の回文配列で構成されています。loxP 部位でのCre 媒介組み換えの産物は、 loxP 部位の位置と相対的な方向に依存します。両方とも loxP 部位を含む 2 つの別々の DNA 種は、Cre 媒介組み換えの結果として融合を受ける可能性があります。2 つの loxP 部位の間にある DNA 配列は、「 floxed 」と呼ばれます。この場合、Creを介した組み換えの産物はloxP部位の方向に依存します。同じ方向を向いている2つのloxP部位の間にあるDNAはDNAの環状ループとして切除され、反対方向を向いている2つのloxP部位の間にあるDNAは反転されます。[1]この酵素は、機能するために追加の補因子（ ATPなど）や補助タンパク質を必要としません。 [2]
この酵素は、線状ゲノムの環化やDNA複製後に形成される二量体染色体の分解など、P1バクテリオファージのライフサイクルにおいて重要な役割を果たしている。[3]
Creリコンビナーゼは分子生物学の分野で広く使用されているツールです。この酵素のユニークで特異的な組み換えシステムは、遺伝子ノックアウトやノックイン研究など、幅広い研究で遺伝子や染色体を操作するために利用されています。この酵素は、哺乳類、植物、細菌、酵母など、さまざまな細胞環境で効率的に機能するため、Cre-Lox組み換えシステムを膨大な数の生物で使用でき、科学研究で特に有用なツールとなっています。[4]
発見
1981 年に Sternberg と Hamilton が行った研究では、バクテリオファージ「P1」が独自の部位特異的組換えシステムを持つことが実証されました。P1バクテリオファージゲノムのEcoRI断片が生成され、ラムダベクターにクローニングされました。6.5kb EcoRI 断片 (断片 7) が効率的な組換えイベントを可能にすることがわかりました。[5]これらの組換えイベントのメカニズムは、細菌のRecAおよびRecBCDタンパク質が存在しない状態で発生するため、独特であることがわかっていました。この組換えシステムの構成要素は、欠失変異誘発研究を使用して解明されました。これらの研究により、効率的な組換えイベントが発生するには、P1 遺伝子産物と組換え部位の両方が必要であることが示されました。P1 遺伝子産物はCre (環化組換え)、組換え部位は loxP (交差( x )座、P 1) と名付けられました。[5] Creタンパク質は1983年に精製され、35,000 Daのタンパク質であることが判明しました。[2]精製されたタンパク質のリコンビナーゼ活性には、ATPや補助タンパク質などの高エネルギー補因子は必要ありません。 [2]初期の研究では、Creは非特異的DNA配列に結合する一方で、loxP配列に対しては20倍高い親和性を持つことも実証されており、初期のDNAフットプリント研究の結果では、Cre分子がloxP部位に二量体として結合することも示唆されています。[2]
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構造
Cre リコンビナーゼは、2 つの異なるドメインを形成する 343 個のアミノ酸で構成されています。アミノ末端ドメインは残基 20～129 を包含し、このドメインには一連の短いループで連結された 5 つのアルファ ヘリックスセグメントが含まれています。ヘリックス A と E は、リコンビナーゼ テトラマーの形成に関与しており、ヘリックス E の C 末端領域は、隣接するサブユニットの C 末端ドメインと接触することが知られています。ヘリックス B と D は、loxP DNA の主溝と直接接触します。これら 2 つのヘリックスは、loxP 部位の DNA 塩基と 3 回直接接触すると考えられています。酵素のカルボキシ末端ドメインは、アミノ酸 132～341 で構成され、酵素の活性部位を収容しています。このドメインの全体構造は、 λ インテグラーゼや HP1 インテグラーゼなど、同じファミリーの他の酵素の触媒ドメインと構造的に非常によく似ています。このドメインは主にらせん構造をしており、9つの異なるらせん（F−N）があります。末端のらせん（N）はカルボキシドメインの本体から突き出ており、このらせんは他のサブユニットとの相互作用を媒介する役割を果たしていると言われています。結晶構造は、この末端Nらせんがその疎水性表面を隣接するCreサブユニットのアクセプターポケットに埋め込んでいることを実証しています。[6]
2つのドメイン構造の効果は、DNAを反対側からつかむC字型のクランプを形成することです。[3]
アクティブサイト
Cre酵素の活性部位は、保存された触媒トライアド残基Arg 173、His 289、Arg 292と、保存された求核残基Tyr 324およびTrp 315で構成されています。Flpリコンビナーゼなどの一部のリコンビナーゼ酵素とは異なり、Creは個別のサブユニット間で共有の活性部位を形成せず、活性部位に寄与するすべての残基が1つのサブユニット上にあります。その結果、2つのCre分子が1つのloxP部位に結合すると、2つの活性部位が存在します。Creを介した組み換えにはシナプスの形成が必要であり、その中で2つのCre-LoxP複合体が会合して、4つの異なる活性部位が存在するシナプステトラマーと呼ばれるものを形成します。[6] Tyr 324は求核剤として機能し、DNA基質への共有結合3'-ホスホチロシン結合を形成します。切断可能なリン酸（切断部位で求核攻撃の対象となるリン酸）は、触媒トライアドの3 つのアミノ酸残基（Arg 173、His 289、Trp 315）の側鎖によって調整されます。トリプトファン315のインドール窒素も、この切断可能なリン酸と水素結合を形成します。（注：ヒスチジンは、他のチロシンリコンビナーゼファミリーのメンバーでもこの部位を占め、同じ機能を果たします）。この反応により DNA が切断され、5' ヒドロキシル基が解放されます。このプロセスは、シナプステトラマーに存在する 4 つのリコンビナーゼサブユニットのうち 2 つの活性部位で発生します。5' ヒドロキシル基が 3'-ホスホチロシン結合を攻撃すると、DNA 鎖の 1 対が交換され、ホリデイジャンクション中間体が形成されます。[3]
アプリケーション
バクテリオファージP1における役割
CreリコンビナーゼはP1バクテリオファージのライフサイクルにおいて重要な役割を果たします。細胞に感染すると、Cre-loxPシステムがP1 DNAの環状化を引き起こします。さらにCreは、ファージの細胞分裂中に形成される二量体溶原性P1 DNAを分解するためにも使用されます。[7]
研究での使用
誘導性 Cre 活性化は、タモキシフェンの投与後にのみ活性化される CreER (エストロゲン受容体) 変異体を使用して達成されます。[8]これは、エストロゲン受容体の変異したリガンド結合ドメインを Cre リコンビナーゼに融合することで行われ、その結果、Cre はタモキシフェンによって特異的に活性化されます。タモキシフェンが存在しない場合、CreER は変異したリコンビナーゼを細胞質に輸送します。このタンパク質は、タモキシフェンが投与されるまで、不活性化状態でこの場所に留まります。タモキシフェンが導入されると、4-ヒドロキシタモキシフェンに代謝され、これが ER に結合して CreER を核に移行させ、そこで lox 部位を切断できるようになります。[9]重要なのは、タモキシフェンが存在しない場合でも、Creリコンビナーゼ分子が核内に漏れ出し、非常に敏感なレポーターと組み合わさって意図しない細胞標識が生じるため、蛍光レポーターが活性化されることがあるということです。[10] CreER(T2)は、タモキシフェンに依存しない組み換えを最小限に抑え、タモキシフェンの感受性を最大化するために開発されました。
改善点
近年、Creリコンビナーゼは、哺乳類の好ましいコドンへの変換、報告されている潜在的スプライス部位の除去、終止コドンの変更、哺乳類におけるエピジェネティックサイレンシングのリスクを軽減するためのCpG含有量の削減などの改良が行われている。[11]精度が向上した変異体も数多く特定されている。[12]
参照
- Cre-Lox組み換え
- FLP-FRT組み換え
- Cre/loxP システム(ドイツ語)
参考文献
- ^ Nagy A (2000年2月). 「Creリコンビナーゼ：ゲノム調整のための万能試薬」Genesis . 26 (2): 99–109. doi : 10.1002/(SICI)1526-968X(200002)26:2<99::AID-GENE1>3.0.CO;2-B . PMID 10686599.
- ^ abcd Abremski K, Hoess R (1984年2月). 「バクテリオファージP1部位特異的組換え。Creリコンビナーゼタンパク質の精製と特性」. The Journal of Biological Chemistry . 259 (3): 1509–1514. doi : 10.1016/S0021-9258(17)43437-5 . PMID 6319400.
- ^ abcd Van Duyne GD (2001). 「cre-loxp部位特異的組み換えの構造的見解」。Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure。30 : 87–104。doi : 10.1146/annurev.biophys.30.1.87。PMID 11340053 。
- ^ Ennifar E、Meyer JE、Buchholz F、Stewart AF、Suck D (2003 年 9 月)。「野生型 Cre リコンビナーゼ loxP シナプスの結晶構造は、DNA 切断活性化の代替メカニズムを示唆する新しいスペーサー構造を明らかにしました」。核酸研究 。31 ( 18 ): 5449–5460。doi :10.1093 / nar/gkg732。PMC 203317。PMID 12954782。
- ^ ab Sternberg N, Hamilton D (1981年8月). 「バクテリオファージP1部位特異的組換え。I. loxP部位間の組換え」。Journal of Molecular Biology . 150 (4): 467–486. doi :10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID 6276557.
- ^ ab Guo F, Gopaul DN, van Duyne GD (1997年9月). 「部位特異的組換えシナプスでDNAと複合体を形成したCre組換え酵素の構造」. Nature . 389 (6646): 40–46. Bibcode :1997Natur.389...40G. doi :10.1038/37925. PMID 9288963. S2CID 4401434.
- ^ Shaikh AC、Sadowski PD (1997 年2月)。「Cre リコンビナーゼは lox サイトをトランス切断する」。The Journal of Biological Chemistry。272 ( 9): 5695–5702。doi : 10.1074/jbc.272.9.5695。PMID 9038180。
- ^ Walrath JC、 Hawes JJ、Van Dyke T、 Reilly KM (2010)。「がん研究における遺伝子操作マウスモデル」。がん研究の進歩。106 ：113–64。doi ：10.1016/S0065-230X（10）06004-5。ISBN 9780123747716. PMC 3533445 . PMID 20399958.
- ^ Kristianto J、Johnson MG、Zastrow RK、Radcliff AB、Blank RD（2017年6月）。「Cre-ERT2のin vivoでの自発的リコンビナーゼ活性」。トランスジェニック研究。26 （3）：411–417。doi ：10.1007 / s11248-017-0018-1。PMC 9474299。PMID 28409408。S2CID 4377498 。
- ^ アルバレス＝アスナール A、マルティネス＝コラル I、ダウベル N、ベツホルツ C、マキネン T、ゲーンゲル K (2020 年 2 月)。 「T2ライン」。トランスジェニック研究。29 (1): 53–68。土井：10.1007/s11248-019-00177-8。PMC 7000517。PMID 31641921。
- ^ Shimshek DR、Kim J、Hübner MR、Spergel DJ、Buchholz F、Casanova E、Stewart AF、Seeburg PH、Sprengel R (2002 年 1 月)。 「マウスにおけるコドン改善された Cre リコンビナーゼ (iCre) 発現」。ジェネシス。32 (1): 19-26。土井：10.1002/gene.10023。PMID 11835670。S2CID 46000513 。
- ^ Eroshenko N 、Church GM (2013年9 月)。「精度が向上した Cre リコンビナーゼの変異体」。Nature Communications。4 : 2509。Bibcode : 2013NatCo ...4.2509E。doi : 10.1038/ncomms3509。PMC 3972015。PMID 24056590。
外部リンク
- 米国国立医学図書館の医学主題標目表(MeSH)における Cre リコンビナーゼ