ケモプロテオミクス

ケモプロテオミクス（化学プロテオミクスとも呼ばれる）には、タンパク質と小分子の相互作用を特定し、調査するために使用される幅広い技術が含まれます。^[1]ケモプロテオミクスは、疾患表現型の緩和に基づいてリード化合物を発見することを目指すパラダイムである表現型創薬を補完するものであり、ターゲットベースの創薬（リバース薬理学）とは対照的です。ターゲットベースの創薬では、リード化合物は、事前に決定された疾患を促進する生物学的ターゲットと相互作用するように設計されます。^[2]表現型創薬アッセイでは化合物の作用機序を確認できないため、ケモプロテオミクスは、潜在的なターゲットを絞り込み、最終的に分子の作用機序を検証するための貴重なフォローアップ戦略を提供します。^{[2]ケモプロテオミクスは、}プロテオーム全体の規模でタンパク質と小分子の相互作用を分析することにより、小分子創薬における薬物の乱用という固有の課題にも対処しようとしています。ケモプロテオミクスの主な目的は、薬物候補のインタラクトームを特徴づけ、オフターゲット毒性と多剤併用のメカニズムについての洞察を得ることである。^[3]

ケモプロテオミクスアッセイは、3 つの基本的なタイプに分類できます。溶液ベースのアプローチでは、溶液中の標的タンパク質を化学的に修飾し、識別のためにタグ付けする薬物類似体を使用します。固定化ベースのアプローチでは、結合パートナーを固定した支持体に固定することにより、潜在的な標的またはリガンドを単離します。誘導体化を使用しないアプローチでは、結合時のタンパク質安定性または薬物クロマトグラフィーの変化を観察することにより、薬物 - 標的相互作用を推測することを目的としています。計算技術は、潜在的な薬物- 標的ペアを裏付ける証拠の並行ラインとしてケモプロテオミクス ツールキットを補完し、リード最適化の情報を提供する構造モデルを生成するために使用されます。注目度の高い薬物のいくつかの標的がケモプロテオミクスを使用して特定されており、質量分析計の感度と化学プローブ技術の継続的な改善は、ケモプロテオミクスが将来の薬物発見において大きな役割を果たすことを示しています。

ヒトゲノム計画の完了に続いて、疾患治療における新しいパラダイムへの期待が高まった。多くの致命的かつ難治性の疾患は特定の遺伝子にマッピングすることができ、疾患におけるそれらのタンパク質産物の役割をより深く理解するための出発点となった。新薬発見では、特に疾患の発症におけるタンパク質の不在の影響を強調する動物ノックアウトモデルが使用され、医薬品化学者は計算化学を活用して、疾患の原因となるタンパク質に対する高親和性化合物を生成した。^[3]しかし、FDAによる新薬承認率は過去10年間で低下している。^{[4]新薬の失敗の潜在的な原因の1つは、初期新薬発見と後期}新薬発見の断絶である。^[3]初期新薬発見は、成功の強力な予測因子である標的の遺伝学的検証に焦点を当てているが、ノックアウトおよび過剰発現システムは単純すぎる。空間的および時間的に条件付きのノックアウト/ノックインシステムにより、タンパク質機能のin vivo分析のニュアンスのレベルは向上したが、依然として薬理作用の全身的範囲と完全に一致させるには至っていない。^[3]例えば、薬物は複数のメカニズムを介して作用することが多く、標的を部分的に作用させることで最もよく機能します。^[3]ケモプロテオミクスツールは、治療の成功に関与する多くのタンパク質を特定することにより、疾患の遺伝学的理解と薬物作用の薬理学的理解との間のギャップを埋めるソリューションを提供します。 ^[要出典]

ケモプロテオミクスツールキットは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MSまたはLC-MS）に基づく定量的プロテオミクスによって支えられており、生物学的サンプル中の複雑なプロテオームのほぼ完全な同定と相対的定量化を可能にします。 ^[5]プロテオーム分析に加えて、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、最近ではユビキチン化などの翻訳後修飾の検出も可能であり、これらは細胞の機能状態への洞察をもたらします。^[5]プロテオーム研究の大部分は、高解像度のオービトラップ質量分析計を使用して分析され、サンプルは一般化可能なワークフローを使用して処理されます。標準的な手順はサンプル溶解から始まり、ここでタンパク質は、塩、ジスルフィド結合を還元するジチオトレイトールなどの薬剤、およびチオール基をキャップするアルキル化剤（ヨードアセトアミドなど）を含む変性バッファーに抽出されます。変性タンパク質は、多くの場合トリプシンでタンパク質分解され、LC-MS/MSによる分析の前に他の混合物成分から分離されます。より正確な定量化のために、異なるサンプルをアイソバリックタンデムマスタグ（TMT）と反応させることができます。アイソバリックタンデムマスタグは、サンプルの多重化を可能にする化学バーコードの一種です。^[5]

広範なプロテオームおよびトランスクリプトームのプロファイリングは、生物医学分野で数え切れないほどの進歩をもたらしましたが、RNAおよびタンパク質発現の特性評価は、タンパク質の機能特性に関する情報を提供する能力において限界があります。転写およびタンパク質発現情報では、翻訳後修飾およびタンパク質間相互作用が酵素活性に及ぼす影響に関する知識にギャップがあり、酵素活性は細胞タイプ、疾患状態、および生理学的条件によって異なるため、状況に応じて酵素活性をプロファイリングするには特殊なツールが必要です。^[6]さらに、特定された酵素の多くは、機能アッセイの基礎となる実用的なメカニズムを生み出すのに十分な特性評価が行われていません。機能的な生化学的読み出しの基礎がなければ、薬物-タンパク質相互作用を検出するには化学ツールが必要です。

活性ベースタンパク質プロファイリング（ABPP、活性ベースプロテオミクスとも呼ばれる）は、酵素活性部位の内因性 リガンドに対する可用性をモニターするために開発された技術である。^[5] ABPPでは、酵素の活性部位に入り込んで共有結合を形成する特別に設計されたプローブを使用し、これにより酵素が活性状態であることを確認する。^[7]プローブは通常、メカニズムが研究されている薬物の類似体であるため、酵素の共有結合標識は薬物結合の指標となる。ABPPプローブは、3つの主要な機能単位で設計されている：（1）部位特異的共有結合弾頭（反応基）、（2）ビオチンやローダミンなどのレポータータグ、および（3）リンカー基。^[8]部位特異的共有結合弾頭は共有結合修飾子とも呼ばれ、酵素の活性部位のセリン、システイン、またはリジン残基を共有結合で修飾し、他のリガンドとの将来の相互作用を防ぐ求電子剤です。 ^[7] ABPPプローブは一般に酵素クラスに対して設計されているため、細胞状態が酵素ネットワークに与える影響についてシステムレベルの情報を提供できます。 レポータータグは、酵素が反応基で標識されていることを確認するために使用され、下流の読み出しに応じて変化します。最も広く使用されているレポーターは、イメージングを可能にする蛍光部分と、標識酵素のプルダウンと質量分析による分析を可能にするビオチンなどのアフィニティータグです。各戦略には欠点があり、蛍光レポーターではプロテオーム解析のための濃縮ができませんが、ビオチンベースのアフィニティータグは内因的にビオチン化されたタンパク質と共精製されます。^[8]リンカー基は反応基をレポーターに結合するために使用され、理想的にはプローブの活性を変えない方法で結合される。最も一般的なリンカー基は長いアルキル鎖、誘導体化されたPEG、および修飾されたポリペプチドである。^[5]

酵素は、システムの生理学的または発達的状態に応じて構造、機能、および関連性が変化するという仮定の下では、酵素の活性部位へのアクセス性も変化すると推測できます。^[6]したがって、ABPPプローブが酵素を標識する能力も、条件によって異なります。したがって、プローブの結合は、さまざまな状況での酵素の機能特性に関する情報を明らかにすることができます。ハイスループットスクリーニングは、特に競合阻害アッセイの分野でABPPの恩恵を受けています。競合阻害アッセイでは、生物学的サンプルを薬物候補とともに事前にインキュベートし、次に標的酵素への結合についてABPPプローブと競合させます。標的に対する親和性の高い化合物はプローブの結合を防ぎ、プローブの結合の程度は化合物の親和性の指標として使用できます。ABPPプローブは酵素のクラスを標識するため、このアプローチは薬物の選択性のプロファイルにも使用できます。選択性の高い化合物は、理想的には少数のタンパク質でのみプローブに勝つためです。^[8]

プローブが結合するとタンパク質が標識されるABPPとは異なり、光親和性標識プローブは、タンパク質と共有結合する前に光分解による活性化を必要とする。 ^[7]光反応性基の存在によりこれが可能になる。^{[7]これらのプローブは、3つの結合した}部分で構成される：（1）薬物足場、（2）フェニルアジド、フェニルジアジリン、ベンゾフェノンなどの光反応性基、および（3）ビオチン、蛍光染料、クリックケミストリーハンドルなどの識別タグ。^[9]薬物足場は通常、メカニズムが研究されている薬物の類似体であり、重要なことに、標的に可逆的に結合するため、ほとんどの薬物とその標的との相互作用をよりよく模倣する。^[9]光反応性基にはいくつかの種類がありますが、それらはABPPプローブとは根本的に異なります。ABPPは標的の活性部位の求核性アミノ酸を特異的に標識しますが、光親和性標識は非特異的であるため、より広範囲の標的の標識に適用できます。^[7]識別タグは、行われる分析の種類によって異なります。ビオチンとクリックケミストリーハンドルは、質量分析に基づく識別の前に標識されたタンパク質を濃縮するのに適していますが、蛍光染料は、 SDS-PAGEなどのゲルベースのイメージング法を使用して標的との相互作用を検証するときに使用されます。 ^{[7] [9]}

光親和性プローブは多機能であるため、設計が難しい。化学者は、薬物に適用される構造活性相関モデリングの同じ原理を光親和性プローブに取り入れるが、薬物骨格の活性や光反応性基の結合能力を損なうことなくそうする必要がある。 ^[9]光反応性基は無差別に結合するため、不適切な設計はプローブが自分自身または非標的タンパク質を標識する原因となる可能性がある。プローブは、保管中、緩衝液中、さまざまなpHレベル、生体システム内で安定していなければならず、光にさらされたときのみ標識が行われるようにする必要がある。放射線は細胞を損傷する可能性があるため、光による活性化も微調整する必要がある。 ^[9]

固定化ベースのケモプロテオミクス技術には、免疫沈降法に似たマイクロビーズベースのアフィニティープルダウン法やアフィニティークロマトグラフィー法のバリエーションが含まれます。どちらの場合も、ベイト分子を固定化した表面として固体支持体が使用されます。ベイト分子は、研究者が標的を同定しようとしている場合は潜在的な薬物であり、研究者が小分子をスクリーニングしている場合は固定化酵素などの標的です。 ^[10]ベイトは潜在的な結合パートナーの混合物にさらされ、非結合成分を除去した後に結合パートナーを同定できます。

マイクロビーズによる固定化は、研究者がプロテオームからタンパク質標的を探すか、化学ライブラリから薬物のような化合物を探すかを決めることができるという点で、モジュール式の技術である。マイクロビーズは肉眼で見やすい上、かさばった部分がタンパク質溶液から容易に除去できるため、比較的労力のかからない濃縮アプリケーションに適している。^[11] マイクロビーズは歴史的に、アガロースやデキストランなどの不活性ポリマーで作られており、選択した餌を付着させるために官能基化されている。タンパク質を餌として使用する場合、アミン官能基は付着を容易にするための一般的なリンカーである。より現代的なアプローチは、処理済みサンプルからビーズ固定化分析物を磁気分離できる、磁性マイクロビーズの一種であるダイナビーズの普及の恩恵を受けている。磁性ビーズは超常磁性特性を示すため、外部磁石を使用して溶液から非常に簡単に除去できる。^[12]簡略化されたワークフローでは、磁性ビーズを使用してタンパク質ターゲットを固定化し、次にビーズを化学ライブラリと混合して潜在的なリガンドをスクリーニングします。高親和性リガンドは固定化されたターゲットに結合し、洗浄による除去に抵抗するため、サンプル中に濃縮されます。逆に、目的のリガンドは、溶解物とのインキュベーションによって固定化され、プロテオームタンパク質に対してスクリーニングすることができます。^[12]

ハイブリッド溶液ベースおよび固定化ベースの戦略が適用されており、ビオチンなどの濃縮タグで機能化されたリガンドを溶液中で自由に浮遊させて標的タンパク質を見つけます。インキュベーション期間後、リガンド-タンパク質複合体をストレプトアビジンでコーティングされたビーズと反応させることができます。ストレプトアビジンはビオチンタグに結合し、プルダウンして相互作用パートナーを特定できます。この技術は、ABPPおよび光親和性標識のサンプルの準備を支援するために拡張できます。固定化アプローチは再現性があり成功していますが、固定化によって誘発される立体障害の制限を回避することは不可能であり、これが誘導適合を妨げます。もう1つの欠点は、タンパク質と小分子の両方がビーズ表面に非特異的に吸着し、偽陽性を生成する可能性があることです。 ^[10]

アフィニティークロマトグラフィーは、酵素を精製するために用いられるまれにしか使われない方法として1950年代に登場したが、それ以来主流となり、ケモプロテオミクス手法の中で最も古いものである。^[13]アフィニティークロマトグラフィーは、リガンド固定化または標的固定化という2つの基本形式のいずれかに従って実行される。リガンド固定化形式では、目的のリガンド（多くの場合、薬剤リード）がクロマトグラフィーカラム内に固定化され、固定相として作用する。細胞溶解物などの多くのタンパク質からなる複雑なサンプルがカラムを通過し、目的のターゲットが固定化リガンドに結合し、他のサンプル成分はカラムに保持されずに通過する。標的固定化形式では、目的のターゲット（多くの場合、疾患関連タンパク質）がクロマトグラフィーカラム内に固定化され、固定相として作用する。次に、プールされた化合物ライブラリがアプリケーションバッファー内でカラムを通過し、リガンドは固定相との結合相互作用により保持され、他の化合物は保持されずにカラムを通過する。^[14]どちらの場合も、カラムに保持された分析対象物はカラムから溶出され、質量分析法を用いて同定される。溶出戦略の表を以下に示す。

上記のアプローチは成功を収めているが、誘導体化が必要であるという本質的な限界があり、誘導体化された化合物が模倣すると言われている相互作用の親和性が損なわれ、立体障害が生じる。^[10]固定化されたリガンドとターゲットは、天然のタンパク質-リガンド相互作用を再現する方法で空間を自由に移動する能力が制限されており、タンパク質または薬物が固定化されている場合、誘導適合からの構造変化はしばしば制限される。プローブベースのアプローチはまた、リガンドに官能基を導入することによってリガンド-タンパク質相互作用の3次元的性質を変え、化合物の活性を変える可能性がある。誘導体化フリーのアプローチは、多くの場合結合時のタンパク質安定性の変化の観察を通じて、また時にはクロマトグラフィーの共溶出を通じて、代理で相互作用を推測することを目的としている。^[15]

以下の安定性に基づく方法は、タンパク質の立体配座状態の平衡濃度におけるリガンド誘導シフトにより機能すると考えられています。溶液中の単一のタンパク質タイプは、さまざまな立体配座の個々の分子によって表される場合があり、それらの多くはアミノ酸配列が同一であるにもかかわらず互いに異なります。薬物に結合すると、リガンドに結合したタンパク質の大部分はエネルギー的に好ましい立体配座に入り、安定性の低い配座異性体の予測できない分布から離れます。^{[16]したがって、リガンド結合はタンパク質を安定化させ、}熱、酵素、化学分解に対して抵抗力を持たせると言われています。安定性に基づく誘導体化フリーのアプローチの例をいくつか以下に示します。

熱プロテオームプロファイリング（細胞熱シフトアッセイとも呼ばれる）は、リガンド結合によって誘発されるタンパク質の熱安定性の変化からリガンド-タンパク質相互作用を推測する最近普及した戦略です。一般的なアッセイ設定では、タンパク質を含むサンプルを選択したリガンドにさらし、それらのサンプルを小分けして個別の温度ポイントまで加熱します。リガンドに結合すると、タンパク質の熱安定性が増加すると予想されるため、リガンド結合タンパク質は熱変性に対してより耐性になります。加熱後、残っている非変性タンパク質の量を定量的プロテオミクスを使用して分析し、安定性曲線を生成します。未処理の安定性曲線と比較すると、処理後の曲線は右にシフトすることが予想され、リガンド誘導による安定化が発生したことを示します。歴史的に、熱プロテオームプロファイリングは、既知の対象ターゲットに対するウェスタンブロットを使用して評価されてきました。高解像度のオービトラップ質量分析計の登場により、このタイプの実験はプロテオーム全体の規模で実行でき、安定性曲線を一度に数千のタンパク質に対して生成できるようになりました。熱プロテオームプロファイリングは、in vitro、in situ、in vivoで成功裏に実施されています。質量分析と組み合わせると、この技術は質量分析細胞熱シフトアッセイ（MS- CETSA ）と呼ばれます。^[17]

薬物親和性応答性標的安定性アッセイは、 TPPと同様の基本的な仮定、すなわちリガンド結合によってタンパク質の安定性が増加するという仮定に従っています。しかし、DARTSでは、タンパク質の安定性はプロテアーゼによる消化に応答して評価されます。簡単に言うと、細胞溶解液のサンプルを目的の小分子とともにインキュベートし、サンプルをアリコートに分割し、各アリコートをプロテアーゼの添加後に限定的なタンパク質分解にかけます。限定的なタンパク質分解は重要です。なぜなら、完全なタンパク質分解では、リガンド結合タンパク質でさえ完全に消化されてしまうからです。次に、サンプルをSDS-PAGEで分析して消化の程度の違いを評価し、バンドを切り出して質量分析で分析し、タンパク質分解に抵抗するタンパク質の同一性を確認します。あるいは、ターゲットがすでに疑われており、検証のためにテストされている場合は、ウェスタンブロットプロトコルを使用してタンパク質を直接特定することができます。^[18]

酸化速度によるタンパク質の安定性もまた、リガンド結合がタンパク質を分解様式（今回はメチオニン残基の酸化）から保護するという仮定に基づいています。SPROXでは、溶解物を分割して薬剤またはDMSO対照で処理し、次に各グループをさらにカオトロープおよび変性剤グアニジン塩酸塩（GuHCl）の濃度を増加させながら個別のサンプルに等分します。GuHClの濃度に応じて、タンパク質はさまざまな程度に展開します。次に各サンプルを過酸化水素と反応させ、メチオニン残基を酸化します。薬剤によって安定化されたタンパク質は、より高いGuHCl濃度でも折り畳まれたままになり、メチオニンの酸化が少なくなります。酸化されたメチオニン残基は、 LC-MS/MSで定量化し、薬剤結合の代理となるメチオニン安定性曲線を作成するために使用できます。 SPROX アッセイには欠点があり、SPROX サンプルから得られる関連ペプチドはメチオニン残基を持つペプチドのみであり、これはペプチドの約 3 分の 1 を占めますが、現在、実行可能な濃縮技術はありません。酸化にさらされたメチオニンのみが意味のある情報を提供し、メチオニン酸化の違いがすべてタンパク質の安定化と一致するわけではありません。濃縮なしでは、これらのペプチドのLC-MS/MS分析は困難です。これは、他のサンプル成分が質量分析計のノイズに寄与し、関連する信号がかき消されてしまう可能性があるためです。したがって、SPROX サンプルは、LC-MS/MS分析の前に、目的のペプチドを濃縮するために分画する必要があります。^[16]

親和性選択質量分析（AS-MS）の採用によりアッセイ形式の拡大が見られましたが、^[19]一般的な手法は単純なスキームに従っています。タンパク質ターゲットを小分子とともにインキュベートして安定したリガンド-タンパク質複合体を形成させ、結合していない小分子を混合物から除去し、残りのリガンド-タンパク質複合体の成分を質量分析法を使用して分析します。^[19]識別された結合リガンドはヒットとして分類され、リード生成の出発点として使用できます。AS-MSは結合を偏りなく測定するため、ヒットを機能的読み出しに結び付ける必要がなく、アロステリック調節因子や化学シャペロンなど、活性部位を超えて作用する薬物をすべて1回のアッセイで識別できる可能性があります。^[20]小分子は正確な質量で直接識別できるため、ヒットの妥当性を確認するために誘導体化は必要ありません。 ^[20]誘導体化およびラベルフリーのアプローチの中で、AS-MSは、1回の実験で複数の試験化合物を評価できるという独自の利点があります。文献では、1回の実験で最大20,000の化合物が報告されており、あるグループは、異種タンパク質プールに対する化学ライブラリの分析を報告しています。^[20] AS-MSの基本的な手順については、以下で詳しく説明します。

一般的なAS-MSワークフローは、精製されたタンパク質 溶液（すなわち、標的タンパク質）をマイクロプレート内の化学ライブラリとプレインキュベーションすることから始まります。アッセイは、構造類似体間の結合部位の競合を防ぐのに十分な高タンパク質濃度を含むように設計することができ、さまざまな親和性にわたるヒットを識別できるようにします。逆に、アッセイは、高親和性類似体と低親和性類似体を区別し、構造活性相関に情報を提供できるように、低タンパク質濃度を含むことができます。^[20]化学ライブラリの選択は、機能読み出しがないため、他のハイスループットスクリーニング戦略よりも厳密ではありません。そうでなければ、生物学的活性を生成するソース化合物のデコンボリューションが必要になります。したがって、AS-MSの典型的な範囲は、プールあたり400〜3,000化合物です。^[20]スクリーニングにおけるその他の考慮事項は、より実用的なものであり、例えば、通常マイクロモル範囲である所望の化合物濃度と、化合物のストック溶液が通常10ミリモル溶液として保存されるという事実とのバランスをとる必要性などがある。これにより、スクリーニングされる化合物の数は実質的に数千に制限される。^[20]適切な試験化合物と標的が選択され、インキュベートされた後、リガンド-タンパク質複合体は、さまざまな方法で分離することができる。^[19]

アフィニティー選択に続いて、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーにより未結合の小分子が除去され、下流の分析にはタンパク質に結合したリガンドのみが利用可能となる。^[19]圧力ベース、遠心分離、沈殿ベースの限外濾過など、スループットの程度が異なる数種類の限外濾過が報告されている。^[19]圧力ベースと遠心分離の両方の形式で、未結合の小分子は、サイズに基づいてタンパク質を排除する半透膜を通過させられる。未結合の小分子を完全に除去するためには、限外濾過後に複数回の洗浄ステップが必要である。 [ 19 ]限外濾過は、膜^への未結合の小分子の非特異的吸着によっても妨げられる可能性がある。^[19]イリノイ大学のグループは、リガンドを使用してタンパク質を安定化させ、凝集を防ぐアミロイドβを含むスクリーニング戦略を発表した。限外濾過法を用いて凝集したアミロイドβを沈殿させ、未結合リガンドを除去し、リガンド安定化タンパク質を質量分析法を用いて検出し定量した。^[19]

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、工業用 医薬品の発見においてより広く使用されており、限外濾過に比べて非結合化合物をより効率的に除去できるという利点がある。^[19] サイズ排除アプローチは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）ベースおよびスピンカラム形式の両方で説明されている。 ^[19]どちらの場合も、非結合リガンド、タンパク質、リガンド-タンパク質複合体の混合物が多孔質ビーズのカラムを通過させられる。リガンド-タンパク質複合体はビーズに入ることが排除され、すぐにカラムから出ていくが、非結合リガンドはビーズを通過する必要があり、カラムに長時間保持される。したがって、カラムから早い段階で溶出するリガンドは、タンパク質に結合していると推測される。^[19]シェリング・プラウ社が開発した自動リガンド同定システム（ALIS）は、 HPLCベースのSECと液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）システムを組み合わせたもので、 SECを使用してリガンド-タンパク質複合体を未結合リガンドから分離し、複合体をLC-MSシステムに転送して結合リガンドのオンライン分析を行います。^[19]ノバルティスのスピードスクリーンは、ゲル濾過クロマトグラフィーとしても知られる96ウェルスピンカラム形式のSECを使用しており、最大96個のサンプルから未結合リガンドを同時に除去することができます。 ^[21]サンプルは多孔質ビーズにも通されますが、サンプルをカラムに通すために遠心分離が使用されます。 ^{[21]スピードスクリーンは}LC-MSシステムに結合されておらず、最終分析の前にさらに処理が必要です。この場合、リガンドをターゲットから切り離し、個別に分析する必要があります。

最終段階では、結合したリガンドをその標的から生物学的に分離し、続いて液体クロマトグラフィー-質量分析法を用いてリガンドを同定する必要がある。^[20] AS-MSは、完全な複合体のトップダウンプロテオーム検出によって直接的に、または小分子-タンパク質複合体の変性に続いて質量分析法を用いて小分子を同定することによって間接的に、小分子-タンパク質相互作用を同定する手段を提供する。^[19]トップダウンアプローチでは、相互作用を保存し、液体から気体への移行時にその完全性を維持するのに十分穏やかな条件下で、複合体をエレクトロスプレーイオン化質量分析源に直接注入する必要がある。^{[19]これは1991年にGanemとHenionによって可能であることが示されたが、}ハイスループットには適していない。^[19]興味深いことに、ペプチドの構造解明に典型的に使用される電子捕獲解離は、トップダウン分析中にリガンド結合部位を特定するために使用されている。^{[19]結合した}リガンドを分析するより簡単な方法は、タンパク質沈殿抽出法を用いてタンパク質を変性させ、リガンドを沈殿溶液に放出し、その後、希釈してLC-MSシステムで同定する方法である。

クロマトグラフィー共溶出による標的同定は、薬物処理後のタンパク質安定性の違いに依存しない。代わりに、薬物が標的タンパク質と安定した複合体を形成し、それらの複合体がクロマトグラフィー分離に耐えられるほど堅牢であるという仮定に基づいている。典型的なワークフローでは、細胞溶解物を薬物とともにインキュベートし、次に溶解物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに注入して分画する。溶解物タンパク質はイオン強度勾配に沿って溶出され、短い時間間隔で分画が収集される。各分画は、タンパク質と薬物の両方の含有量についてLC-MS/MSによって分析される。個々のタンパク質は特徴的なプロファイルで溶出され、プレインキュベートされた薬物は、それらが複合体を形成する標的の溶出プロファイルを反映するはずである。薬物とタンパク質の溶出プロファイルの相関関係により、標的を絞り込み、推測することができる。^[22]

ベンチトップケモプロテオミクスアッセイの開発と応用は、多くの場合時間がかかり、コストも高額です。分子ドッキングシミュレーションは、小分子とタンパク質の相互作用の強さをランク付けするための比較的低コストで高スループットの手段として登場しました。分子ドッキングには、原子分解能でのリガンドとタンパク質の立体配座の正確なモデリングが必要であり、そのため、多くの場合、X線結晶構造解析や極低温電子顕微鏡などの直交法によるタンパク質構造の経験的決定によって支援されます。分子ドッキング戦略は、対象のリガンドとタンパク質についてすでにわかっている情報の種類によって分類されます。^[23]

構造が既知の生理活性リガンドを、構造情報が限られているタンパク質に対してスクリーニングする場合、リガンド構造に関するモデリングが行われます。ファーマコフォアモデリングでは、同様の生理活性構造類似体の治療活性に関連する主要な電子的および構造的特徴が特定されるため、予測力を高めるために、対応する実験データを含む大規模なライブラリが必要です。化合物の構造は仮想的に重ね合わされ、共通要素は生理活性の傾向に基づいてスコア付けされます。^[24]鍵と鍵穴に基づくモデリングから誘導適合に基づくモデリングへの移行により、結合予測は改善されましたが、リガンドの柔軟性をモデリングするという課題も生じました。これには、コンフォメーションモデルのデータベースを構築する必要があり、大量のデータストレージスペースを使用します。もう 1 つのアプローチは、いわゆるオンザフライ方式で、ファーマコフォアモデリングのプロセス中にデータベースを使用せずにコンフォメーションモデルをテストします。この方法では、必要なストレージスペースが大幅に少なくなりますが、計算時間は長くなります。^[24] 2 つ目の課題は、類似体構造をどのように重ね合わせるかという決定から生じます。一般的なアプローチは、重ね合わせに最小二乗回帰を使用することですが、これはユーザーが選択したアンカーポイントを必要とするため、プロセスに人間のバイアスを導入します。ファーマコフォアモデルにはトレーニングデータセットが必要であり、モデルを適切にトレーニングするための適切な化合物ライブラリを選択するという別の課題が生じます。データセットのサイズと化学物質の多様性は、下流製品のパフォーマンスに大きな影響を与えます。^[25]

理想的には、薬物ターゲットの構造がわかっており、それによって構造ベースのファーマコフォア モデリングが可能になります。構造ベースのモデルは、相互作用点の空間分布など、タンパク質の結合部位の主要な構造特性を、リガンド ベースのファーマコフォア モデルから特定された特徴と統合し、リガンドとタンパク質の相互作用の全体的なシミュレーションを生成します。構造ベースのモデリングにおける主な課題は、最初に特定された多くのファーマコフォアの特徴を、優先度の高い特徴のセットに絞り込むことです。あまりに多くの特徴をモデリングすると、計算上の課題になります。もう 1 つの課題は、ファーマコフォアモデリングと定量的構造活性相関 (QSAR)プロファイリングの非互換性です。正確なQSARモデルは、治療ターゲットだけでなく、多くの潜在的なターゲットを含めることに依存します。例えば、重要なファーマコフォアは治療標的と高親和性相互作用を示す可能性があるが、望ましくないオフターゲット活性を引き起こす可能性もあり、またシトクロムP450などの代謝酵素の基質となる可能性もある。したがって、治療標的に対するファーマコフォアモデリングは、化合物の全体的な構造活性相関の1つの要素にすぎない。^[24]

ケモプロテオーム戦略は、薬物標的の範囲を拡大するために使用されてきた。^[26]歴史的に成功した薬物は、薬物標的タンパク質の明確に定義された結合ポケットを標的としているが、これらは注釈付きプロテオームの約15％のみを定義している。^[26]薬局方を成長させ続けるためには、リガンド発見への大胆なアプローチが必要である。 ABPPの使用は、偶然にも、新しいリガンド可能部位の探索を再活性化させた。酵素活性部位を標識するために意図的に使用されるABPPプローブは、多くの異なるタンパク質上の多くの求核領域を意図せずに標識することが判明している。当初は実験ノイズであると考えられていたこれらの意図しない反応は、研究者に、新しい共有結合性薬物の標的となる可能性のある部位の存在を示唆した。これは、阻害する酵素活性を持たないタンパク質、または変異した薬剤耐性タンパク質の場合に特に顕著である。いずれの場合も、タンパク質は、タンパク質分解標的キメラ（PROTAC）という新しい薬物モダリティを使用して分解の標的にすることができる可能性があります。^{[26] PROTACは、標的と}E3ユビキチンリガーゼと相互作用するように設計されたヘテロ二機能性小分子です。この相互作用により、E3ユビキチンリガーゼが標的に十分近づくため、標的は分解対象として標識されます。プロテオーム全体に潜在的な共有結合部位が存在することは、多くの薬剤がこのようなモダリティを使用して共有結合的に標的にできることを示唆しています。^[26]

ケモプロテオミクスは、薬物再利用の最前線にあります。これは、抗ウイルス活性を持つFDA承認薬を迅速に特定する必要性が高まったCOVID-19の時代に特に関連しています。 ^[27]この文脈では、ウイルスプラーク形成の阻害など、in vitroで望ましい効果を持つ薬物を特定するために、通常、表現型スクリーニングが採用されています。薬物が陽性反応を示した場合、次のステップは、それが既知の標的に作用しているのか、それとも新しい標的に作用しているのかを判断することです。したがって、ケモプロテオミクスは、表現型スクリーニングのフォローアップです。COVID -19の場合、Frimanらは、パンデミックで使用された最初の再利用薬の1つである広域スペクトル抗ウイルス薬レムデシビルのオフターゲット効果を調査しました。^{[27]レムデシビルは、物議を醸している薬物}ヒドロキシクロロキンとともに、HepG2細胞熱シフトアッセイにおける熱プロテオームプロファイリングによってテストされ、研究者らはレムデシビルの潜在的なオフターゲットとしてTRIP13を発見した。 ^[27]

承認薬がハイスループットスクリーニングでヒットとして特定されることはない。スクリーニングに用いられる化学ライブラリがどのターゲットに対しても最適化されていないためである。しかし、アフィニティークロマトグラフィーやアフィニティー選択質量分析法などの方法は製薬業界の主力であり、特にAS-MSは薬物化が困難な多くのクラスのタンパク質にわたってかなりの数のヒットを生み出すことが文書化されている。^[20]これは主に、 1回のアッセイでスクリーニングできるリガンドの量が膨大であることによる。上海科技大学のiHuman研究所の研究者は、プールあたり20,000の化合物を薬物に対する難しいGタンパク質共役受容体であるA _2A Rに対してスクリーニングするというスキームを採用し、ヒット率は0.12%で、いくつかの高親和性リガンドを導き出した。^[20]

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