ビオチン化

生化学において、ビオチン化はタンパク質、核酸、またはその他の分子にビオチンを共有結合させるプロセスです。ビオチン化は迅速かつ特異的であり、ビオチンのサイズが小さいため (MW = 244.31 g/mol)、分子の自然な機能を阻害する可能性は低いです。ビオチンは、極めて高い親和性、速い結合速度、および高い特異性でストレプトアビジンおよびアビジンに結合し、これらの相互作用は、目的のビオチン化分子を単離するためにバイオテクノロジーの多くの分野で利用されています。ストレプトアビジンおよびアビジンへのビオチンの結合は、極端な熱、pH、およびタンパク質分解に耐性があるため、さまざまな環境でビオチン化分子を捕捉できます。また、複数のビオチン分子を目的のタンパク質に結合させることができるため、複数のストレプトアビジン、アビジン、またはニュートラアビジンタンパク質分子を結合させることができ、目的のタンパク質の検出感度が向上します。広範囲の標識方法を利用するビオチン化試薬は多数存在します。ビオチンとストレプトアビジンの強い親和性により、ビオチン化タンパク質の精製は、分子生物学において タンパク質間相互作用やユビキチン化^{[1]などの翻訳後イベントを特定するための広く使用されているアプローチです。}

タンパク質は化学的または酵素的にビオチン化できます。化学的ビオチン化では、さまざまな結合化学を利用して、アミン、カルボキシレート、スルフヒドリル、炭水化物の非特異的ビオチン化を実現します (たとえば、NHS 結合により、タンパク質内の任意の第一級アミンがビオチン化されます)。酵素ビオチン化では、細菌のビオチンリガーゼによって特定の配列内の特定のリジンがビオチン化されます。^[2] ほとんどの化学的ビオチン化試薬は、ビオチンの吉草酸側鎖にリンカーを介して結合した反応性基で構成されています。アビジン/ストレプトアビジンのビオチン結合ポケットはタンパク質表面の下に埋め込まれているため、より長いリンカーを持つビオチン化試薬が望まれます。これにより、ビオチン分子がターゲットに結合されると、結合アビジン/ストレプトアビジン/ニュートラアビジンタンパク質にアクセスしやすくなります。このリンカーはビオチン化試薬の溶解性にも影響を与えます。ポリ(エチレン)グリコール(PEG) を組み込んだリンカーは、水不溶性試薬を溶解性にしたり、すでにある程度溶解しているビオチン化試薬の溶解性を高めたりすることができます。

化学的ビオチン化法とは対照的に、酵素的ビオチン化では、タンパク質中に存在する残基の1つにビオチンを結合させることができる。このビオチン化反応は完了まで進むことも可能であり、これは生成物が非常に均一に生成され、MHCマルチマーなどのように、定義された方向でストレプトアビジンに結合できることを意味する。酵素的ビオチン化は、大腸菌ビオチンホロ酵素合成酵素（ビオチンリガーゼとも呼ばれる）（BirA、P06709）によって最も頻繁に行われる。 ^{[3] [4]}

目的のタンパク質を標的とする最も一般的な方法は、タンパク質のN末端、C末端、または内部ループを15アミノ酸ペプチド（GLNDIFEAQKIEWHE）は、AviTagまたはアクセプターペプチド（AP）と呼ばれます。^[5]タグが付けられたタンパク質は、次にBirAとともにインキュベートされ、ビオチンとATPの存在下でビオチン化が起こります。^{[5]酵素ビオチン化は}in vitroで行うことができますが、BirAは哺乳類や細菌の細胞内や細胞表面でも標的ペプチドと特異的に反応しますが、他の細胞タンパク質は変更されません。^{[6] [7] [8]}酵素ビオチン化は、通常、Avitagタグ付きタンパク質とBirAの共発現を通じて体内でも行うことができます。 ^[9]

BirAの天然基質はビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（BCCP）です。より小さなタグが発見される前は、標的とするためにタンパク質をBCCP全体に融合する必要がありました。^{[10] BCCPと融合したタンパク質は、}生体内でビオチン分子によって認識され、それに結合することができます。^[11] AviTag以前にもいくつかの小さなタグが使用されていましたが、これまでのところAviTagが最も効率的です。^[4]

タンパク質分子を修飾するための最も一般的なターゲットは、リジン側鎖のイプシロンアミンおよび N 末端の α アミンとして存在する第一級アミン基です。アミン反応性ビオチン化試薬は、水溶性に基づいて 2 つのグループに分けられます。

N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルは水溶液への溶解性が低い。水溶液中での反応では、まず有機溶媒に溶解し、次に水性反応混合物に希釈する必要がある。この目的で最も一般的に使用される有機溶媒はジメチルスルホキシド（DMSO）とジメチルホルムアミド（DMF）であり、低濃度ではほとんどのタンパク質と適合性がある。^[12] NHSエステルの疎水性のため、NHSビオチン化試薬は細胞膜を介して拡散することができ、細胞の内部と外部の両方の成分をビオチン化することを意味する。

スルホ-NHS エステルは水に溶けやすく、加水分解されやすいため、使用直前に水に溶かす必要があります。スルホ-NHS エステルの水溶性は、N-ヒドロキシスクシンイミド環のスルホン酸基に由来し、試薬を有機溶媒に溶かす必要がありません。ビオチンのスルホ-NHS エステルは細胞膜を透過しないため、細胞表面のビオチン化試薬としても使用できます。

NHS- エステルとスルホ-NHS エステルの化学反応は、どちらもアミンと自発的に反応してアミド結合を形成するという点で本質的に同一です。エステルのターゲットは脱プロトン化された第一級アミンであるため、反応は塩基性条件 (pH 7 以上) で優先されます。NHSエステルの加水分解は主要な競合反応であり、加水分解の速度はpH の上昇とともに増加します。NHS- エステルとスルホ-NHS エステルの半減期は pH 7 では数時間ですが、pH 9 ではわずか数分です。

NHS エステルを第一級アミンに結合する条件には、ある程度の柔軟性があります。インキュベーション温度は 4 ～ 37 °C、反応中の pH 値は 7 ～ 9、インキュベーション時間は数分から 12 時間です。アミン (トリスやグリシンなど) を含むバッファーは、反応と競合するため、使用しないでください。

第一アミンのビオチン化の代替として、スルフィドリル基をビオチンで標識する方法があります。遊離スルフィドリル基は第一アミンに比べてほとんどのタンパク質上であまり一般的ではないため、第一アミンが標的タンパク質の調節ドメインに位置する場合、またはビオチン化レベルを低下させる必要がある場合に、スルフィドリルビオチン化が有用です。マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィドなどのスルフィドリル反応性基は、結合に遊離スルフィドリル基を必要とするため、まずジスルフィド結合を還元してスルフィドリル基をビオチン化できるようにする必要があります。遊離スルフィドリル基が利用できない場合は、リジンをさまざまなチオール化試薬（トラウト試薬、SAT（PEG4）、SATA、およびSATP）で修飾して、遊離スルフィドリルを追加することができます。スルフィドリルビオチン化は、NHS エステルによる標識よりもわずかに低い pH (6.5 ～ 7.5) で実行されます。

タンパク質全体の他に、合成中にアミノ酸鎖の末端にシステイン (Cys)残基を導入して部位特異的かつ方向性のあるビオチン化を実現することで、ビオチン化ペプチドを合成できます。ヌクレオチドも、チオール化ヌクレオチドを組み込むことでビオチン化できます。

カルボキシル基は、タンパク質の C 末端とグルタミン酸およびアスパラギン酸アミノ酸側鎖に存在します。カルボキシル基を標的とするビオチン化試薬には、カルボキシル反応性部分自体はありませんが、代わりにEDCなどのカルボジイミド架橋剤を使用して、ビオチン化試薬の第一級アミンを標的タンパク質のカルボキシル基に結合させます。

カルボキシル基のビオチン化は pH 4.5～5.5 で起こります。架橋剤と緩衝液成分の交差反応を防ぐため、緩衝液には第一級アミン（トリス、グリシンなど）やカルボキシル基（酢酸、クエン酸など）を含めないでください。MES緩衝液が理想的な選択肢です。

糖タンパク質は、炭水化物残基をアルデヒドに修飾し、ヒドラジンまたはアルコキシアミンベースのビオチン化試薬と反応させることでビオチン化できます。過ヨウ素酸ナトリウムは、糖タンパク質上のシアリン酸をアルデヒドに 酸化して、pH 4～6 でこれらの安定した結合を形成します。

ポリクローナル抗体は高度にグリコシル化されており、グリコシル化は抗体の活性を妨げないため、グリコシル基をビオチン化することはビオチン化抗体を生成する理想的な戦略です。

オリゴヌクレオチドは、市販のビオチンホスホラミダイトを用いたホスホラミダイト法によってオリゴヌクレオチド合成の過程で容易にビオチン化される。 ^[13]標準的な脱保護後、得られた複合体は逆相または陰イオン交換HPLCを使用して精製することができる。

光活性化ビオチン化試薬は、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、炭水化物を標識に使用できない場合に最適です。これらの試薬は、紫外線(UV; >350 nm) によって活性化され、CH および NH 結合で反応するアリールアジドに依存します。これらのタイプの結合はアミノ酸のタイプとは無関係に発生するため、このタイプのビオチン化は「非特異的」と呼ばれます。

光活性化ビオチン化試薬は、特定の時間または条件で 反応物を紫外線にさらすだけで、実験中の特定の時間または特定の反応条件下でビオチン化を活性化するためにも使用できます。

ビオチンタグは、ビオチンの天然リガンドであるアビジン（またはストレプトアビジン、ニュートラアビジン）が結合したカラムと一緒にアフィニティークロマトグラフィーで使用できます。ただし、アビジン/ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を破壊するには厳しい条件（例：pH 1.5の6M GuHCl）が必要であり、ビオチンタグを持つタンパク質が変性する可能性が高くなります。タグ付きタンパク質を分離する必要がある場合は、タンパク質をイミノビオチンでタグ付けする方がよいでしょう。このビオチン類似体は、アルカリ性pHでアビジン/ストレプトアビジンに強く結合しますが、pHを下げると親和性が低下します。したがって、イミノビオチンタグ付き機能性タンパク質は、pHを下げる（pH 4程度まで）ことでアビジン/ストレプトアビジンカラムから放出できます。^{[14] [15]}

このタグは、抗ビオチン抗体や、酵素レポーター（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）や蛍光プローブなどのアビジン/ストレプトアビジンタグ検出戦略を介してタンパク質の検出にも使用できます。これは、蛍光顕微鏡または電子顕微鏡、 ^[16] ELISAアッセイ、ELISPOTアッセイ、ウェスタンブロット、およびその他の免疫分析法による局在化に役立ちます。一価ストレプトアビジンによる検出は、ビオチン化された標的のクラスター化または凝集を回避できます。^[17]

ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの間に形成される非共有結合は、ほとんどの抗原と抗体の結合よりも高い結合親和性を持ち、共有結合の強度に近づきます。この非常に強い結合により、ビオチンによるタンパク質の標識は、固定化アビジンまたはストレプトアビジンを使用してビオチン化タンパク質を他のタンパク質と生化学物質の混合物から分離するアフィニティークロマトグラフィーなどの用途に有用なツールとなります。ビオチン化ウシ血清アルブミン (BSA) などのビオチン化タンパク質は、マルチウェルアッセイプレートのウェル表面のコーティングとして固相アッセイで使用されます。赤血球のビオチン化は、クロム 51 などの放射性標識を使用せずに全血液量を測定する手段として使用されており、これにより、必要な量の放射能に曝露できない低出生体重児や妊婦の血液量を測定できます。さらに、MHC 分子をビオチン化してMHC マルチマーを作成することは、抗原特異的T 細胞集団を識別および分離するための有用なツールとなっています。最近では、生体内タンパク質ビオチン化が、生きた細胞内のタンパク質間相互作用と近接性を研究するために開発されました^{[18] [19] [20]}

ビオチン化の反応条件は、標的分子（抗体など）が分子を精製または検出するのに十分なビオチン分子で標識され、かつビオチンが分子の機能に干渉しない程度に選択される。

HABA (2-(4-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸) アッセイは、ビオチン化の程度を判定するために使用できます。HABA 染料はアビジンまたはストレプトアビジンに結合し、特徴的な吸光度を生み出します。ビオチン化されたタンパク質または他の分子が導入されると、ビオチンが染料を置き換え、500 nm での吸光度が変化します。この変化は、サンプル内のビオチン レベルに正比例します。HABA アッセイの欠点は、大量のサンプルを使用することです。

ビオチン化の程度はストレプトアビジンゲルシフトによっても測定できる。これは、ストレプトアビジンがアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動中にビオチンに結合したままであるためである。ビオチン化された標的の割合は、過剰なストレプトアビジンの有無にかかわらず、標的のバンド強度の変化によって測定でき、ビオチン化されたタンパク質はクマシーブリリアントブルー染色によって迅速かつ定量的に観察される。^[21]

• ハーマンソン、GT バイオコンジュゲートテクニック。アカデミックプレスISBN 0-12-342336-8 
• ビオチン化の概要 - 反応基、ビオチン、リンカー領域に関する追加情報と図が含まれています。
• Gao, Wenqing; Wu, Zengru; Bohl, Casey E.; Yang, Jun; Miller, Duane D.; Dalton, James T. (2005). 「ヒト、ラット、イヌの肝臓酵素製剤を用いた選択的アンドロゲン受容体モジュレーターのin vitro代謝の特性評価」。薬物代謝と体内動態。34 (2): 243–53。doi :  10.1124 /dmd.105.007112。PMC 2039882。PMID 16272404。