蛍光体

蛍光体（または蛍光色素、発色団に類似）は、光励起により光を再放射することができる蛍光 化合物である。蛍光体は通常、いくつかの芳香族基、またはいくつかのπ結合を持つ平面または環状分子を含む。^[1]

蛍光体は単独で使用される場合もあれば、液体中のトレーサー、特定の構造を染色するための染料、酵素の基質、またはプローブや指示薬（蛍光が極性やイオンなどの環境要因によって影響を受ける場合）として使用される場合もあります。より一般的には、蛍光体は高分子に共有結合し、親和性試薬または生物活性試薬（抗体、ペプチド、核酸）のマーカー（または染料、タグ、レポーター）として機能します。蛍光体は、蛍光イメージングや分光法などのさまざまな分析方法で組織、細胞、または材料を染色するために特に使用されます。

フルオレセインは、アミン反応性イソチオシアネート誘導体フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を介して、最も人気のある蛍光体の一つとなっている。抗体標識から、カルボキシフルオレセインのおかげで核酸にまで用途が広がっている。歴史的に一般的な他の蛍光体としては、ローダミン（TRITC）、クマリン、シアニンの誘導体がある。^[2]多くが独自のものである新しい世代の蛍光体は、同等の励起および発光を持つ従来の染料よりも光安定性が高く、明るく、pH感受性が低いなど、性能が優れていることが多い。^{[3] [4]}

蛍光体は特定の波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長の光を再放射します。吸収された波長、エネルギー移動効率、放射までの時間は、蛍光体の構造と化学環境の両方に依存します。これは、励起状態の分子が周囲の分子と相互作用するためです。最大吸収 (≈ 励起) および放射 (たとえば、吸収/放射 = 485 nm/517 nm) の波長は、特定の蛍光体を指すために使用される一般的な用語ですが、スペクトル全体を考慮することが重要になる場合があります。励起波長スペクトルは、非常に狭いまたはより広い帯域である場合もあれば、カットオフ レベルを超える場合もあります。放射スペクトルは通常、励起スペクトルよりもシャープで、波長が長く、それに応じてエネルギーが低くなります。励起エネルギーは紫外線から可視スペクトルまでの範囲であり、放射エネルギーは可視光から近赤外線領域まで続きます。

蛍光体の主な特性は次のとおりです。

• 最大励起および発光波長（ナノメートル（nm）で表記）：励起スペクトルと発光スペクトルのピークに対応します（通常はそれぞれ 1 つのピーク）。
• モル吸光係数（mol ⁻¹ cm ⁻¹単位）：特定の波長で吸収される光の量と溶液中の蛍光体の濃度を結び付けます。
• 量子収率: 入射光から放出された蛍光に伝達されるエネルギーの効率（吸収された光子あたりの放出された光子の数）。
• 寿命（ピコ秒）：蛍光体が励起状態から基底状態に戻るまでの持続時間。励起された蛍光体の集団が元の量の1/ e （≈0.368）に減衰するのにかかる時間を指します。
• ストークスシフト: 最大励起波長と最大発光波長の差。
• 暗分率：蛍光を発しない分子の割合。量子ドットの場合、長時間の単分子顕微鏡観察により、全粒子の20～90%が蛍光を発しないことが判明した。^[5]一方、共役ポリマーナノ粒子（Pdot）では、蛍光に暗分率がほとんど見られない。^[6] 蛍光タンパク質は、タンパク質のミスフォールディングや発色団の形成不良により暗分率を持つことがある。^[7]

これらの特性は、光退色や光耐性（連続光励起による蛍光の消失）などの他の特性に影響します。蛍光体分子の極性、蛍光体のサイズと形状（偏光蛍光パターンなど）、およびその他の要因によって蛍光体の挙動が変化する可能性があるため、他のパラメータも考慮する必要があります。

蛍光体は、他の蛍光染料の蛍光を消光したり、さらに長い波長で蛍光を中継したりするためにも使用できます。

ほとんどの蛍光体は20～100個の原子からなる有機小分子（200～1000ダルトン。グラフト修飾や共役分子によっては分子量が高くなる場合がある）だが、タンパク質であるはるかに大きな天然蛍光体も存在する。緑色蛍光タンパク質（GFP）は27kDaで、いくつかのフィコビリタンパク質（PE、APCなど）は≈240kDaである。2020年現在、最も小さい既知の蛍光体は3-ヒドロキシイソニコチンアルデヒドであるとされており、これは14個の原子から成り、わずか123Daの化合物である。^[8]

量子ドット（直径2～10nm、原子100～100,000個）のような蛍光粒子も蛍光体とみなされます。 ^[9]

蛍光体のサイズによって、タグ付けされた分子が 立体的に妨害され、蛍光極性が影響を受ける可能性があります。

蛍光分子は単独で利用することも、機能システムの蛍光モチーフとして利用することもできます。分子の複雑さと合成方法に基づいて、蛍光分子は一般に、タンパク質とペプチド、小さな有機化合物、合成オリゴマーとポリマー、および多成分システムの4つのカテゴリに分類できます。^{[10] [11]}

蛍光タンパク質GFP、YFP、RFP (それぞれ緑、黄、赤) は、他の特定のタンパク質に結合して融合タンパク質を形成し、適切なプラスミドキャリアのトランスフェクション後に細胞内で合成されます。

非タンパク質有機蛍光体は、以下の主要な化学ファミリーに属します。

• キサンテン誘導体： フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド
• シアニン誘導体：シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン
• スクアライン誘導体および環置換スクアライン（セタ染料およびスクエア染料を含む）
• スクアラインロタキサン誘導体：タウ色素を参照
• ナフタレン誘導体（ダンシル誘導体およびプロダン誘導体）
• クマリン誘導体
• オキサジアゾール誘導体：ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール
• アントラセン誘導体： DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK Orangeを含むアントラキノン
• ピレン誘導体：カスケードブルーなど
• オキサジン誘導体： ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170など
• アクリジン誘導体： プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど
• アリールメチン誘導体： オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン
• テトラピロール誘導体： ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン
• ジピロメテン誘導体： BODIPY、アザBODIPY

これらの蛍光体は、バンドを飛び越えて吸収したエネルギーを安定化させることができる非局在化電子のために蛍光を発します。たとえば、最も単純な芳香族炭化水素の1つであるベンゼンは、254 nmで励起され、300 nmで発光します。^{[12]これにより、蛍光体と蛍光半導体}ナノ粒子である量子ドットが区別されます。

これらは、アミノ基 (活性エステル、カルボキシレート、イソチオシアネート、ヒドラジン)、カルボキシル基 (カルボジイミド)、チオール(マレイミド、アセチル臭化物)、有機アジド(クリックケミストリー経由または非特異的 (グルタルアルデヒド))などの特定の官能基にタンパク質に結合できます。

さらに、様々な官能基が存在することで、溶解度などの特性を変えたり、糖に結合するボロン酸や特定の陽イオンに結合する複数のカルボキシル基などの特別な特性を付与したりすることができる。染料が芳香族系の両端に電子供与基と電子受容基を含む場合、この染料は環境の極性に敏感になる可能性があり (ソルバトクロミック)、そのため環境感受性と呼ばれる。染料は荷電分子を通さない細胞内で使用されることが多く、その結果、カルボキシル基はエステルに変換され、細胞内のエステラーゼによって除去される (例:フラ-2AMおよびフルオレセインジアセテート)。

以下の染料ファミリーは商標グループであり、必ずしも構造上の類似性を共有するものではありません。

• CF染料（バイオティウム）
• DRAQ および CyTRAK プローブ (BioStatus)
• ボディピー（インビトロジェン）
• エバーフルオール（セタレ・バイオテック）
• Alexa Fluor (インビトロジェン)
• ベラフルオール（セタレバイオテック）
• DyLight Fluor (サーモサイエンティフィック、ピアス)
• アトとトレイシー（シグマアルドリッチ）
• FluoProbes (インターキム)
• アベリオール染料（アベリオール）
• DY および MegaStokes 染料 (Dyomics)
• スルホサイ染料（シアンダイ）
• HiLyte Fluor (アナスペック)
• Seta、SeTau、および Square Dyes (SETA BioMedicals)
• Quasar および Cal Fluor 染料 ( Biosearch Technologies )
• SureLight 染料 ( APC、RPE PerCP、フィコビリソーム) (Columbia Biosciences)
• APC、APCXL、RPE、BPE (Phyco-Biotech、Greensea、Prozyme、Flogen)
• Vio Dyes (ミルテニーバイオテック)

略語:

• Ex (nm): 励起波長（ナノメートル）
• Em (nm): 発光波長（ナノメートル）
• MW:分子量
• QY:量子収率

StayGoldとmStayGold は、生細胞イメージングの分野に大きく貢献した先進的な蛍光タンパク質です。高い光安定性と明るさで知られる StayGold は、もともと二量体蛍光タンパク質として設計されましたが、効果的である一方で、凝集と標識の精度に関連する課題がありました。^[15]これらの制限に対処するために、mStayGold は単量体変異体として設計され、正確なタンパク質標識における有用性を高めました。mStayGold は優れた光安定性を示し、高照度条件下でも蛍光を維持し、以前の変異体 StayGold と比較して明るさが向上しています。さらに、成熟が速いため、トランスフェクション後のイメージングが迅速になります。これらの進歩により、mStayGold は単一分子追跡や動的な細胞プロセスの高解像度イメージングなど、さまざまな用途に使用できる多目的ツールとなり、生物学研究における蛍光タンパク質の能力が拡大しています。^[16]

略語:

• Ex (nm): 励起波長（ナノメートル）
• Em (nm): 発光波長（ナノメートル）
• MW:分子量
• QY:量子収率
• BR: 明るさ: モル吸光係数 * 量子収率 / 1000
• PS:光安定性: 明るさを 50% 減らすのにかかる時間 [秒]

蛍光体は、生化学やタンパク質研究の分野で特に重要であり、例えば、免疫蛍光法、細胞分析、^[17] 免疫組織化学、^{[3] [18]}および小分子センサー^{[19] [20]}などにおいて重要な役割を果たしています。

蛍光染料は「ネオンカラー」という名前で産業界で幅広く使用されています。たとえば、

• 繊維染色における数トン規模の使用および洗濯用洗剤の蛍光増白剤
• 高度な化粧品処方
• 安全装備と衣服
• 有機発光ダイオード（OLED）
• 美術とデザイン（ポスターと絵画）
• 殺虫剤と実験薬の相乗剤
• 蛍光ペンの染料は輝きのような効果を与えます
• より多くの光/波長を集めるソーラーパネル
• 蛍光海染料は、空中捜索救助隊が水中の物体を見つけるのを助けるために使用されています。

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• 分子プローブハンドブック - 蛍光技術とその応用に関する包括的なリソース。