ウェスタンブロット

医薬品開発、治療標的の特定、および生物学的研究のためには、細胞内のタンパク質の位置を理解することが不可欠です。^{[ 2 ] [ 20 ]}細胞内のタンパク質の細胞内局在とその機能は密接に関連しています。タンパク質の機能と局在の関係は、タンパク質が移動すると、その機能が変化したり、新しい特性を獲得したりする可能性があることを示唆しています。タンパク質の細胞内配置は、さまざまな方法を使用して決定できます。タンパク質の細胞内局在を特定するために、多くの効率的で信頼性の高い計算ツールと戦略が開発され、使用されています。^{[ 21 ]}細胞内分画法の助けを借りて、WBはタンパク質局在の調査と理解のための重要な基本的方法であり続けています。^{[ 2 ]}

抗体は様々なエピトープを持つため、基礎研究と臨床研究の両方で注目を集めています。抗体の特性評価と検証の基礎はエピトープマッピングです。標的タンパク質上の抗体の結合部位（エピトープ）を特定する手順は「エピトープマッピング」と呼ばれます。抗体の結合エピトープを見つけることは、新しいワクチン、診断薬、治療薬の発見と作成に不可欠です。^{[ 2 ]}その結果、抗体エピトープをマッピングするためのさまざまな方法が開発されました。現時点では、ウェスタンブロットの特異性が、他のエピトープマッピング技術と区別する主な特徴です。ウェスタンブロットは、ヒト皮膚サンプル、出血性疾患ウイルスのエピトープマッピングにいくつか応用されています。^{[ 2 ] [ 22 ] [ 23 ]}

ウェスタンブロットを実施する上で重要なステップとして、サンプル調製は効果的に行う必要があります。なぜなら、このアッセイの解釈は、タンパク質抽出および精製プロセスから構成されるタンパク質調製に影響されるからです。^{[ 24 ] [ 3 ]}効率的なタンパク質抽出を達成するには、細胞膜を破裂させて細胞内成分を放出する役割を担う適切な均質化法を選択する必要があります。^{[ 3 ] [ 25 ]}さらに、タンパク質の可溶化プロセスを主導し、タンパク質の分解を防ぐため、十分な量の標的タンパク質含有量を得るには理想的な溶解バッファーが必要です。サンプル調製が完了すると、ゲル電気泳動を利用してタンパク質含有量を分離する準備が整います。^{[ 3 ]}

試料中のタンパク質はゲル電気泳動を用いて分離される。タンパク質の分離は、等電点（pI）、分子量、電荷、またはこれらの要因の組み合わせによって行われる。分離の性質は、試料の処理方法とゲルの性質によって異なる。

ゲル電気泳動で最も一般的なのは、ポリアクリルアミドゲルとドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加した緩衝液を用いる方法です。SDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、ポリペプチドを強力な還元剤で処理して二次構造や三次構造（例えば、スルフィド結合[SS]とスルフィドリル基[SHおよびSH]）を除去した後、変性状態を維持することで、タンパク質を分子量に基づいて分離することができます。サンプルされたタンパク質は負に帯電したSDSで覆われ、実質的に陰イオンとなり、ゲルのアクリルアミドメッシュを通って正に帯電した（高電圧の）陽極（通常は赤いワイヤーが付いている）に向かって移動します。分子量の小さいタンパク質ほどこのメッシュを速く移動するため、タンパク質はサイズ（通常はキロダルトン、kDaで測定）に応じて分離されます。アクリルアミドの濃度はゲルの分解能を決定します。アクリルアミド濃度が高いほど、低分子量タンパク質の分解能が向上します。アクリルアミド濃度が低いほど、高分子量タンパク質の分離能が向上します。ほとんどのブロットでは、タンパク質はゲル上を一方向にのみ移動します。

サンプルはゲル内のウェルにロードされます。通常、1つのレーンはマーカ​​ーまたはラダー用に確保されています。マーカーまたはラダーとは、既知の分子量を持つタンパク質の市販の混合物で、通常は目に見える色のバンドを形成するように染色されています。ゲルに沿って電圧を印加すると、タンパク質はサイズに応じて異なる速度でゲル内を移動します。これらの異なる移動速度（異なる電気泳動移動度）によって、各レーン内でバンドが形成されます。タンパク質バンドをラダーバンドと比較することで、タンパク質の分子量を推定することができます。

また、単一のサンプルからタンパク質を二次元的に展開する二次元ゲル電気泳動法を用いることも可能である。タンパク質は、第一次元では等電点（正味電荷が中性となるpH値）に基づいて分離され、第二次元では分子量に基づいて分離される。

抗体検出でタンパク質にアクセスできるようにするには、ゲル内から固体支持体である膜上に移動させる必要があり、これはプロセスの重要な部分です。膜には、ニトロセルロース（NC）またはポリフッ化ビニリデン（PVDF）の2種類があります。NC膜はタンパク質に対する親和性が高く、保持能力があります。しかし、NCは脆く、ブロットを再プローブに使用できませんが、PVDF膜はブロットを再プローブできます。^{[ 1 ]}タンパク質を転写する最も一般的な方法は、電気ブロッティングと呼ばれます。電気ブロッティングでは、電流を使用して、負に帯電したタンパク質をゲルから正に帯電した陽極に向かって引っ張り、PVDFまたはNC膜に送り込みます。タンパク質は、ゲル内での組織を維持したまま、ゲル内から膜上に移動します。古い転写方法では、ゲルの上に膜を置き、その上にろ紙を重ねます。積層体全体を緩衝液に浸すと、毛細管現象によって緩衝液が紙の上を上昇し、タンパク質も一緒に運ばれてくる。しかし、この方法は手順が長いため、実際にはあまり用いられていない。

いずれの転写プロセスにおいても、タンパク質は検出のために薄い膜層上に露出される。どちらの種類の膜も、非特異的なタンパク質結合特性（すなわち、すべてのタンパク質に均等に結合する特性）を持つことから選ばれている。タンパク質結合は、膜とタンパク質間の疎水性相互作用および電荷相互作用に基づいている。ニトロセルロース膜はPVDF膜よりも安価であるが、はるかに脆く、繰り返しのプローブ操作には耐えられない。

全タンパク質染色により、膜に正常に転写された全タンパク質を可視化できるため、ユーザーはタンパク質転写の均一性を確認し、レーンごとの実際のタンパク質量でターゲットタンパク質を正規化することができます。いわゆる「ローディングコントロール」による正規化は、従来の方法ではハウスキーピングタンパク質の免疫染色に基づいていましたが、多くの利点があるため、最近は全タンパク質染色へと移行しています。^{[ 26 ]}ウェスタンブロットの正規化には、少なくとも7つの異なる全タンパク質染色法が報告されています。ポンソーS、染色不要法、Sypro Ruby、エピココノン、クマシーR-350、アミドブラック、Cy5です。^{[ 26 ]}シグナルノイズを避けるため、全タンパク質染色は膜のブロッキング前に行う必要があります。ただし、抗体後の染色も報告されています。^{[ 27 ]}

膜はタンパク質に結合する能力に基づいて選択されており、抗体と標的の両方がタンパク質であるため、膜と標的タンパク質の検出に使用される抗体との相互作用を防ぐための措置を講じる必要があります。非特異的結合のブロックは、膜を希釈タンパク質溶液（通常はトリス緩衝生理食塩水（TBS）またはI-Block中の3～5%ウシ血清アルブミン（BSA）または脱脂粉乳（どちらも安価））に、 Tween 20またはTriton X-100などの界面活性剤を微量（0.1%）加えた溶液に入れることによって達成されます。入手しやすさから脱脂粉乳が好ましいですが、牛乳中のすべてのタンパク質がすべての検出バンドと適合するわけではないため、適切なブロッキング溶液が必要です。^{[ 1 ]} 希釈溶液中のタンパク質は、標的タンパク質が結合していないすべての場所で膜に結合します。したがって、抗体が添加されると、抗体は膜に結合できず、したがって利用可能な結合部位は特定の標的タンパク質のみになります。これにより、ウェスタンブロットの最終生成物におけるバックグラウンドが低減され、より鮮明な結果が得られ、偽陽性が排除される。

検出プロセスでは、レポーター酵素に結合した修飾抗体を用いて、膜上の目的タンパク質を「プローブ」します。適切な基質に曝されると、この酵素が発色反応を起こし、色を呈します。従来、このプロセスは様々な理由から2段階で行われていましたが、現在では特定の用途向けに1段階で検出できる方法も利用可能です。

未結合のプローブを洗い流した後、ウェスタンブロットは、標識され目的のタンパク質に結合したプローブを検出する準備が整います。実際には、すべてのウェスタンブロットが膜上の1つのバンドにのみタンパク質を検出するわけではありません。染色されたバンドを電気泳動中にロードされたマーカーまたはラダーのバンドと比較することによって、サイズの概算が取られます。このプロセスは、サンプル間で変化しないはずのアクチンやチューブリンなどの構造タンパク質に対して一般的に繰り返されます。グループ間のコントロールのために、ターゲットタンパク質の量は構造タンパク質に対して正規化されます。より優れた戦略は、トリクロロエタノール^{[ 29 ] [ 30 ]}またはエピココノン^{[ 31 ]}で可視化された総タンパク質に対して正規化することです。この方法は、エラーや不完全な転写の場合に膜上の総タンパク質の量を補正することを保証します。（ウェスタンブロットの正規化を参照）

蛍光検出

蛍光標識プローブは光によって励起され、励起光の発光は、適切な発光フィルターを備えたCCDカメラなどの光センサーによって検出され、ウェスタンブロットのデジタル画像が取得され、分子量分析や定量的ウェスタンブロット分析などのさらなるデータ解析が可能になります。蛍光は定量化に最適な方法の1つと考えられていますが、化学発光よりも感度が低くなります。^{[ 32 ]}

ニトロセルロース膜とPVDF膜の主な違いの1つは、それぞれが抗体を「剥離」して、後続の抗体プローブのために膜を再利用できるかどうかに関係しています。ニトロセルロース膜の剥離には確立されたプロトコルがありますが、より頑丈なPVDFは剥離が容易で、バックグラウンドノイズによって実験が制限される前に再利用できます。もう1つの違いは、ニトロセルロースとは異なり、PVDFは使用前に95%エタノール、イソプロパノール、またはメタノールに浸す必要があることです。PVDF膜は、使用中に厚く、損傷に対する耐性が高い傾向があります。^{[ 33 ]}

ウェスタンブロットの結果が再現可能であることを保証するためには、上記で述べたさまざまなパラメータ、すなわち、試料調製、ロードに使用するタンパク質の濃度、ゲルの割合と泳動条件、さまざまな転写方法、ブロッキング条件の試み、抗体の濃度、および同定と定量方法を報告することが重要です。発表された多くの論文では、これらの変数すべてを網羅していません。したがって、WB の再現性と精度を高めるために、さまざまな実験状況またはパラメータを記述することが不可欠です。WB の再現性を高めるには、最低限の報告基準が必要です。^{[ 2 ] [ 34 ]}

抗体と抗原の使用量に関連するいくつかの理由により、バンドのシグナルが弱かったり、検出されなかったりする場合があります。この問題は、供給元のデータシートに記載されている理想的な抗原と抗体の濃度と希釈率を使用することで解決できる可能性があります。検出システムのソフトウェアで露光時間を長くすると、サンプルと抗体の濃度が低いことが原因で発生する弱いバンドに対処できます。^{[ 2 ]}

タンパク質がプロテアーゼによって分解されると、予測される低分子量バンド以外のいくつかのバンドが現れることがあります。十分なプロテアーゼ阻害剤を用いてタンパク質サンプルを適切に調製することで、多数のバンドの発生を防ぐことができます。一部のタンパク質は二量体、三量体、多量体を形成するため、高分子量領域に複数のバンドが現れることがあります。この問題は、サンプルをより長時間加熱することで解決できる場合があります。翻訳後修飾（PTM）または多数のアイソフォームを持つタンパク質は、さまざまな分子量領域に複数のバンドを生じさせます。PTMは特定の化学物質を用いてサンプルから除去することができ、その際に余分なバンドも除去されます。^{[ 2 ]}

抗体濃度が高すぎる、ブロッキングが不十分、洗浄が不十分、画像撮影時の露光時間が長すぎると、ブロットのバックグラウンドが高くなることがあります。これらの問題を解決することで、ブロットのバックグラウンドが高くなるのを防ぐことができます。^{[ 2 ]}

黒い点、白い斑点や帯、湾曲した帯など、さまざまな奇妙で不均一な帯が出現したと主張されている。ブロックドットは、効果的なブロッキングによってブロットから除去される。白い斑点は、メンブレンとゲルの間の気泡の結果として発生する。主抗体と二次抗体が有意な濃度で存在する場合、ブロットに白い帯が現れる。ゲル電気泳動中に使用される高電圧とタンパク質の急速な移動により、ブロットにスマイリーバンドが現れる。これらの問題を解決することで、ブロットの奇妙な帯は解消される。^{[ 2 ]}