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ハイスループットスクリーニング（HTS）における主要な目標の1つは、望ましい阻害効果または活性化効果を持つ化合物（小分子、siRNA、shRNA、遺伝子などを含む）を選択することです。HTSスクリーニングで望ましい効果を持つ化合物はヒットと呼ばれます。ヒットを選択するプロセスはヒット選択と呼ばれます。[要出典]
ヒット選択の一般的な方法
HTS 実験は、数万（または数百万）の化合物を迅速にスクリーニングする能力を持っています。したがって、ヒット選択のプロセスで大量のデータから化学的/生化学的意義を収集することは困難です。この課題に対処するために、ヒット選択には適切な分析方法が採用されています。大きな効果を持つヒットを選択するための主な戦略は 2 つあります。[1] 1 つは、特定のメトリックを使用して化合物をその効果によってランク付けおよび/または分類し、検証アッセイに実用的な最大数の強力な化合物を選択することです。[2] [3]もう 1 つの戦略は、化合物が事前に設定されたレベルに達するほど十分に強い効果を持つかどうかをテストすることです。この戦略では、偽陰性率 (FNR) および/または偽陽性率 (FPR) を制御する必要があります。[4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11]
HTS 実験には、反復なし (通常は一次スクリーニング) と反復あり (通常は確認スクリーニング) の 2 つの主要なタイプがあります。ヒット選択の分析方法は、これら 2 つのタイプの HTS 実験で異なります。たとえば、z スコア法は反復なしのスクリーニングに適していますが、t 統計は反復ありのスクリーニングに適しています。反復なしのスクリーニングのSSMDの計算も、反復ありのスクリーニングの計算とは異なります。[1]
反復なしのスクリーニング
反復のない一次スクリーニングにおけるヒット選択に使用される指標は多数あります。簡単に解釈できる指標としては、倍数変化、平均差、阻害率、活性率などがあります。しかし、これらすべての指標に共通する欠点は、データの変動を効果的に捉えられないことです。この問題に対処するために、研究者は、ネガティブリファレンスにおけるデータの変動を捉えることができるzスコア法またはSSMDに目を向けました。[12] [13]
z スコア法は、プレート内の調査対象化合物すべての測定値 (通常は対数スケールの蛍光強度) が正規分布するという仮定に基づいています。SSMD も正規性仮定の下で最もよく機能します。ただし、大きな効果を持つ真のヒットは、大多数の化合物と大きく異なる動作をするため、外れ値になります。強力なアッセイアーティファクトも外れ値として動作する可能性があります。したがって、HTS 実験では外れ値は珍しくありません。z スコアと SSMD の通常バージョンは外れ値の影響を受けやすく、問題が発生する可能性があります。その結果、z* スコア法、SSMD *、B スコア法、分位点ベース法などの堅牢な方法が提案され、反復のないプライマリ スクリーニングでのヒット選択に採用されています。[14] [15]
反復のない一次スクリーニングでは、すべての化合物は 1 回だけ測定されます。したがって、各化合物のデータ変動を直接推定することはできません。代わりに、すべての化合物がスクリーニングのプレート内の陰性参照と同じ変動性を持つという強い仮定を立てて、データ変動性を間接的に推定します。z スコア、z* スコア、B スコアはこの強い仮定に依存しており、反復のないケースの SSMD と SSMD* も同様です。
反復試験によるスクリーニング
反復のあるスクリーニングでは、各化合物のデータ変動を直接推定できるため、反復のあるケースではSSMD、zスコアやz*スコアが依存する強い仮定に依存しないt統計などのより強力な方法を使用できます。t統計と関連するp値の使用に関する1つの問題は、サンプルサイズと効果サイズの両方の影響を受けることです。[16]これらは平均差がないことをテストすることから得られるため、小分子またはsiRNAの効果のサイズを測定するようには設計されていません。ヒット選択の場合、主な関心はテストされた小分子またはsiRNAの効果のサイズです。SSMDは効果のサイズを直接評価します。[17] SSMDは、一般的に使用される他の効果サイズよりも優れていることも示されています。[18] SSMDの母集団値は実験間で比較可能であるため、 SSMDの母集団値に同じカットオフを使用してsiRNA効果のサイズを測定できます。[19]
SSMD は、平均倍数変化がデータの変動性を捉えられないという欠点を克服することができます。一方、SSMD は平均と標準偏差の比であるため、平均が小さくても標準偏差が非常に小さい場合は大きな SSMD 値が得られる可能性があります。場合によっては、平均値が小さすぎると生物学的影響がない場合があります。そのため、SSMD 値 (または差異) が大きいが平均値が小さすぎる化合物は興味の対象にならない可能性があります。この問題に対処するために、デュアルフラッシュライトプロットの概念が提案されています。デュアルフラッシュライトプロットでは、実験で調査されたすべての化合物について、 SSMDと平均ログ倍数変化 (または平均阻害/活性化率) をそれぞれ y 軸と x 軸にプロットします。[19]デュアルフラッシュライトプロットでは、図に示すように、遺伝子または化合物が効果サイズで各カテゴリにどのように分布しているかを確認できます。一方、各化合物の平均倍数変化も確認できます。[19] [20]
参照
参考文献
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さらに読む
- Zhang XHD (2011)「最適なハイスループットスクリーニング：ゲノム規模のRNAi研究のための実用的な実験設計とデータ分析、ケンブリッジ大学出版局」