タンパク質沈殿

タンパク質沈殿は、タンパク質を濃縮し、さまざまな汚染物質から精製するために、生物学的製品の下流処理で広く使用されています。たとえば、バイオテクノロジー業界では、タンパク質沈殿は血液に一般的に含まれる汚染物質を除去するために使用されます。^[1]沈殿の基本的なメカニズムは、溶媒の溶媒和ポテンシャルを変更することであり、より具体的には、試薬の添加によって溶質の 溶解度を下げることです。

水性緩衝液中のタンパク質の溶解度は、タンパク質表面の親水性および疎水性アミノ酸残基の分布に依存します。疎水性残基は主に球状タンパク質コアに存在しますが、一部は表面に点在しています。表面に疎水性アミノ酸含有量が多いタンパク質は、水性溶媒への溶解度が低くなります。荷電および極性表面残基は溶媒中のイオン基と相互作用し、タンパク質の溶解度を高めます。タンパク質のアミノ酸組成に関する知識は、理想的な沈殿溶媒と方法を決定するのに役立ちます。

タンパク質が電解質溶液に溶解すると、反発する静電力が生じます。タンパク質間のこれらの反発力は、凝集を防ぎ、溶解を促進します。電解質溶液に溶解すると、溶媒の対イオンがタンパク質の帯電表面残基に向かって移動し、タンパク質の表面に対イオンの剛性マトリックスを形成します。この層の隣には、剛性の低い別の溶媒和層があり、タンパク質表面から離れるにつれて、対イオンの濃度が低下し、共イオンの濃度が増加します。これらの溶媒和層の存在により、タンパク質と他のタンパク質とのイオン相互作用が少なくなり、凝集の可能性が低下します。反発する静電力は、タンパク質が水に溶解した場合にも生じます。水は、タンパク質の親水性表面残基の周りに溶媒和層を形成します。水は、タンパク質の周りに濃度勾配を確立し、タンパク質表面で濃度が最も高くなります。この水ネットワークは、タンパク質間の引力に減衰効果をもたらします。

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  イオン溶媒和層
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  水分補給層

タンパク質間には、永久双極子と誘導双極子を介して分散力または引力が存在します。たとえば、タンパク質上の塩基性残基は、別のタンパク質上の酸性残基と静電相互作用を起こすことができます。ただし、電解液または水中のイオンによる溶媒和は、タンパク質間の引力を低減します。したがって、タンパク質を沈殿させるか蓄積を誘導するには、タンパク質の周囲の水和層を減らす必要があります。タンパク質沈殿で添加される試薬の目的は、水和層を減らすことです。

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  水分補給層

タンパク質沈殿物の形成は段階的なプロセスで起こります。まず、沈殿剤を加え、溶液を徐々に混ぜます。混ぜると沈殿剤とタンパク質が衝突します。分子が流体の渦を横切って拡散するには、十分な混合時間が必要です。次に、タンパク質は核形成段階に入り、そこで顕微鏡レベル以下のサイズのタンパク質凝集体、つまり粒子が生成されます。これらの粒子の成長はブラウン拡散制御下にあります。粒子が臨界サイズ (高せん断場の場合は 0.1 μm ～ 10 μm、低せん断場の場合は 10 μm ) に達すると、個々のタンパク質分子が拡散的に粒子に加わり、互いに衝突してくっついたり凝集したりして成長を続けます。この段階はより遅い速度で起こります。せん断場における老化と呼ばれる最終段階では、沈殿粒子は繰り返し衝突してくっつき、その後ばらばらになり、安定した平均粒子サイズに達します。平均粒子サイズは個々のタンパク質によって異なります。タンパク質粒子の機械的強度は、平均せん断速度と熟成時間の積、つまりキャンプ数と相関関係にあります。熟成により、粒子はポンプや遠心分離機の供給ゾーンで発生する流体せん断力に耐え、サイズが小さくなることがありません。

塩析は、タンパク質を沈殿させる最も一般的な方法です。硫酸アンモニウムなどの中性塩を加えると、溶媒和層が圧縮され、タンパク質間の相互作用が増加します。溶液の塩濃度が増加すると、タンパク質表面の電荷が水ではなく塩と相互作用するため、タンパク質表面に疎水性の部分が露出し、タンパク質が溶液から分離します（凝集して沈殿します）。

塩析は、溶液中の塩の濃度が適切に達したときに自然に起こるプロセスです。タンパク質表面の疎水性パッチは、高度に整列した水殻を生成します。その結果、バルク溶液中の分子と比較して、整列した水分子のエンタルピーΔ Hがわずかに減少し、エントロピーΔ Sが大きく減少します。このプロセスの全体的な自由エネルギー変化 Δ Gは、ギブスの自由エネルギー方程式で表されます。

${\displaystyle \Delta G=\Delta HT\Delta S.}$

Δ G = 自由エネルギーの変化、Δ H = 沈殿時のエンタルピーの変化、Δ S = 沈殿時のエントロピーの変化、T = 絶対温度。 硬い溶媒和層内の水分子が添加された塩との相互作用によってバルク相に戻ると、動きの自由度が増してエントロピーが大幅に増加します。 したがって、Δ G は負になり、自然に沈殿が起こります。

コスモトロープまたは「水構造安定剤」は、タンパク質の周りの溶媒和層から水の消散/分散を促進する塩です。その後、疎水性パッチがタンパク質の表面に露出し、他のタンパク質の疎水性パッチと相互作用します。これらの塩は、タンパク質の凝集と沈殿を促進します。カオトロープまたは「水構造破壊剤」は、コスモトロープと逆の効果があります。これらの塩は、タンパク質の周りの溶媒和層の増加を促進します。コスモトロープ塩のタンパク質沈殿の有効性は、ホフマイスター系列の順序に従います。

降水量が多い降水量が少ない ${\displaystyle \mathrm {PO_{4}^{3-}>SO_{4}^{2-}>COO^{-}>Cl^{-}} }$

降水量が多い降水量が少ない ${\displaystyle \mathrm {NH_{4}^{+}>K^{+}>Na^{+}} }$

タンパク質の溶解度の低下は、図に示すような正規化された溶解度曲線に従います。タンパク質の溶解度と溶液のイオン強度の増加の関係は、Cohn の式で表すことができます。

${\displaystyle \log S=B-KI\,}$

S = タンパク質の溶解度、Bは理想化された溶解度、Kは塩固有の定数、I は添加された塩に起因する溶液のイオン強度です。

${\displaystyle I={\begin{matrix}{\frac {1}{2}}\end{matrix}}\sum _{i=1}^{n}c_{i}z_{i}^{2}}$

z _iは塩のイオン電荷、c _{i は}塩濃度です。タンパク質沈殿に理想的な塩は、特定のアミノ酸組成に最も効果的で、安価で、緩衝作用がなく、汚染のない塩です。最も一般的に使用される塩は硫酸アンモニウムです。0 °C ～ 30 °C の温度範囲で塩析の変動はわずかです。塩溶液に残ったタンパク質沈殿物は、高塩濃度によって タンパク質分解や細菌汚染から保護され、何年も安定した状態を保つことができます。

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  溶解度曲線

等電点(pI) は、タンパク質の正味の一次電荷がゼロになる溶液の pH です。溶液の pH が pI より高い場合、タンパク質の表面は主に負に帯電し、そのため、同じ電荷を持つ分子は反発力を示します。同様に、溶液の pH が pI より低い場合、タンパク質の表面は主に正に帯電し、タンパク質間の反発力が生じます。しかし、pI では負電荷と正電荷が打ち消され、反発する静電力が減少し、引力が優勢になります。引力によって凝集と沈殿が起こります。ほとんどのタンパク質の pI は pH 4～6 の範囲です。沈殿剤としては、塩酸や硫酸などの無機酸が使用されます。等電点沈殿の最大の欠点は、無機酸によって不可逆的な変性が起こることです。このため、等電点沈殿は、標的タンパク質ではなく、汚染タンパク質を沈殿させるために最もよく使用されます。チーズ製造中、またはカゼインナトリウムの製造中に起こるカゼインの沈殿は、等電点沈殿です。

エタノールやメタノールなどの混和性溶媒を溶液に加えると、溶液中のタンパク質が沈殿することがあります。有機溶媒が徐々にタンパク質表面から水を排除し、有機溶媒分子の周囲の水和層に水と結合するにつれて、タンパク質の周囲の溶媒和層は減少します。水和層が小さくなると、タンパク質は静電引力と双極子力によって凝集することができます。考慮すべき重要なパラメータは、温度（変性を避けるために 0 °C 未満である必要があります） 、pH、および溶液中のタンパク質濃度です。混和性有機溶媒は水の誘電率を低下させ、実質的に 2 つのタンパク質が接近できるようにします。等電点では、誘電率とタンパク質の溶解度の関係は次のように表されます。

${\displaystyle \log S=k/e^{2}+\log S^{0}\,}$

S ^0はSの外挿値、eは混合物の誘電率、k は水の誘電率に関連する定数です。血漿タンパク質分画のCohn プロセスでは、エタノールによる溶媒沈殿を利用して個々の血漿タンパク質を分離します。

タンパク質沈殿剤としてのメタノールの使用の臨床応用は、ビリルビンの測定です。

デキストランやポリエチレングリコールなどのポリマーは、可燃性が低く、等電点沈殿よりも生体材料を変性させる可能性が低いため、タンパク質を沈殿させるためによく使用されます。溶液中のこれらのポリマーは、タンパク質の周りの溶媒和層から水分子を引き寄せます。これにより、タンパク質間の相互作用が増加し、沈殿が促進されます。ポリエチレングリコールの特定のケースでは、沈殿は次の式でモデル化できます。

${\displaystyle \ln(S)+pS=X-aC\,}$

Cはポリマー濃度、Pはタンパク質間相互作用係数、aはタンパク質とポリマーの相互作用係数であり、

${\displaystyle x=(\mu _{i}-\mu _{i}^{0})RT}$

μは成分 I の化学ポテンシャル、 Rは普遍気体定数、T は絶対温度です。

アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、タンニン酸、ポリリン酸は、溶液中のタンパク質分子間に拡張ネットワークを形成できます。これらのポリ電解質の有効性は、溶液の pH に依存します。アニオン性ポリ電解質は、等電点未満の pH 値で使用されます。カチオン性ポリ電解質は、pI を超える pH 値で使用されます。ポリ電解質が多すぎると、沈殿物が溶液に溶解して戻ることに注意することが重要です。ポリ電解質凝集の例として、アイリッシュモスを使用してビール麦汁からタンパク質の雲を除去することが挙げられます。

金属塩は、低濃度で酵素や核酸を溶液から沈殿させるために使用できます。よく使用される多価金属イオンは、Ca ²⁺、Mg ²⁺、Mn ²⁺ 、または Fe ²⁺です。

組換えDNAポリメラーゼなどの大量のタンパク質を溶液から 沈殿させるために使用できる工業規模の反応器は数多く存在します。[1]

バッチリアクターは、最もシンプルなタイプの沈殿リアクターです。沈殿剤は、混合しながらタンパク質溶液にゆっくりと添加されます。凝集したタンパク質粒子は、コンパクトで規則的な形状になる傾向があります。粒子は長期間にわたって 広範囲のせん断応力にさらされるため、コンパクトで密度が高く、機械的に安定する傾向があります。

管状リアクターでは、供給タンパク質溶液と沈殿試薬が効率的な混合ゾーンで接触し、その後長いチューブに供給されて沈殿が起こります。体積要素内の流体は、リアクターのチューブを通過する際にプラグフローに近づきます。乱流はチューブ内の金網インサートによって促進されます。管状リアクターは可動機械部品を必要とせず、安価に構築できます。ただし、粒子がゆっくりと凝集すると、リアクターが非現実的なほど長くなることがあります。

CSTRリアクターは、十分に混合されたタンク内で反応物と生成物が連続的に流れ、定常状態で稼働します。新鮮なタンパク質供給物は、沈殿粒子と沈殿試薬がすでに含まれているスラリーと接触します。

• Zellner; et al. (2005 年 6 月). 「血小板のプロテオーム解析におけるさまざまなタンパク質沈殿法の定量的検証」.電気泳動. 26 (12): 2481–9. doi :10.1002/elps.200410262. PMID  15895463.
• ハリソン他著「バイオセパレーション科学と工学」オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、NY 2003年。
• Shuler 他著「バイオプロセス工学: 基本概念(第 2 版)」Prentice Hall International、2001
• Ladisch.バイオセパレーションエンジニアリング. John Wiley & Sons, Inc. ニューヨーク、NY 2001.
• Lydersen.バイオプロセスエンジニアリング. John Wiley & Sons, Inc. ニューヨーク、NY 1994.
• ベルトー、ポール A. バイオセパレーション：バイオテクノロジーのダウンストリーム処理。ジョン ワイリー アンド サンズ社。ニューヨーク、NY 1988 年。