固定化酵素

固定化酵素は、不活性で不溶性の物質、例えばアルギン酸カルシウム（アルギン酸ナトリウム溶液と酵素溶液の混合物を塩化カルシウムと反応させて生成）に結合した、移動性が制限された酵素である。これにより、 pHや温度などの条件の変化に対する耐性が向上する。また、反応中は酵素を所定の位置に保持できるため、反応後に生成物から簡単に分離して再利用できる。これははるかに効率的なプロセスであるため、業界では酵素触媒反応に広く使用されている。酵素固定化の代替法は、全細胞固定化である。^[1]^[2]固定化酵素は取り扱いが容易で、生成物から簡単に分離でき、再利用できる。^[3]

酵素は、細胞内の化学反応を促進する上で重要な役割を果たす生体触媒であり、永続的に変化したり、無駄になったり、化学反応の平衡を崩したりすることはありません。酵素の特性は非常にユニークですが、再利用性、安定性、生産コストの高さなどの理由から、産業界での有用性は限られています。^[4]

歴史

最初の合成固定化酵素は1950年代に作られ、酵素をポリマーマトリックスに組み込んだり、キャリア物質に結合させたりして行われました。また、タンパク質のみを架橋したり、不活性物質を添加したりして架橋法も適用されました。^[3]過去10年間でさまざまな固定化方法が開発されました。たとえば、酵素を事前に合成したキャリア物質に結合する方法は、これまでのところ最も好まれている方法です。新たに、酵素の結晶を架橋する方法も、魅力的な代替法として考えられています。固定化酵素の利用率は着実に増加しています。^[5]

考慮事項

固定化技術を実行する前に、いくつかの要素を念頭に置く必要があります。固定化後の酵素に対する化学的および物理的影響を理解する必要があります。酵素の安定性と運動特性は、捕捉後の酵素の微小環境条件の変化、支持体材料の付着、または酵素作用の生成物などにより変化する可能性があります。さらに、機能的な酵素を得るには、固定化前に酵素の三次構造を維持することを考慮することが重要です。同様に、酵素の機能にとってもう 1 つの重要な部位は活性部位であり、酵素が固定化のために表面に付着している間も活性部位は維持される必要があります。固定化されたが機能しない酵素にならないように、表面/材料の付着には選択的な方法が必要です。^[3]したがって、機能的な固定化酵素の製造には、固定化支持体の選択、固定化の条件と方法という 3 つの基本要素を考慮する必要があります。^[6]

サポートの選択

理想的な支持材料は、親水性で、酵素に対して不活性で、生体適合性があり、微生物の攻撃や圧縮に耐性があり、手頃な価格でなければなりません。^[7]^{[8]支持材料は、最終的には}生体材料タイプであるため、有機または無機、合成または天然（組成によって異なります）にすることができます。すべての酵素の固定化に使用できる支持材料の普遍的なタイプはありません。ただし、シリカベースのキャリア、アクリル樹脂、合成ポリマー、活性膜、交換樹脂など、一般的に使用される支持体がいくつかあります。 ^[6]固定化プロセス自体の前の最も難しいプロセスの1つは、酵素の種類、媒体の反応、流体力学の安全ポリシー、および反応条件に依存するため、支持材料の選択です。^[3]^{[8]異なるタイプの支持体は、}親水性/疎水性、表面化学、および細孔サイズなど、酵素機能に影響を与える物理的および化学的特性と性質が異なります。

方法

酵素は、次のような物理的または化学的方法で固定化できます。

フィジカ

酵素を物理的に支持物質に吸着または付着させる、可逆的な固定化のための簡単な方法。吸着は、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用などの弱い非特異的な力によって起こり、一方イオン結合では酵素は塩結合によって結合します。^[6]
ガラス、アルギン酸ビーズまたはマトリックスへの吸着：酵素は不活性物質の外側に付着します。一般的に、この方法はここに挙げた方法の中で最も遅いです。吸着は化学反応ではないため、固定化された酵素の活性部位がマトリックスまたはビーズによってブロックされ、酵素の活性が大幅に低下する可能性があります。^[9]

罠にかける

これは、特定の領域/空間に酵素を物理的に制限すると考えられる不可逆的な物理的固定化技術です。機械的安定性を高めるために使用でき、酵素の浸出を減らすためにも使用できます。このプロセスでは、酵素は支持繊維/格子のポリマー/材料と化学的に相互作用しないため、時間の経過とともに変性から保護されます。^[6]
基本的に、酵素はアルギン酸カルシウムビーズなどの不溶性ビーズまたはミクロスフェアに閉じ込められています。しかし、これらの不溶性物質は基質の到達と生成物の排出を妨げます。

化学薬品

架橋

架橋：酵素分子を結合するための支持材料を必要としないもう一つの不可逆的な方法。この技術では、酵素分子が互いに共有結合して、ほぼ酵素のみからなるマトリックスを形成する。この反応により、結合部位が酵素の活性部位を覆わず、酵素の活性は不動性によってのみ影響を受ける。しかし、共有結合の柔軟性のなさは、化学吸着された自己組織化単分子膜が示す自己修復特性を妨げる。この場合、ポリ（エチレングリコール）のようなスペーサー分子の使用は、基質による立体障害の低減に役立つ。^[6]

共有結合

酵素は不溶性支持体（シリカゲルやエポキシ基を有するマクロポーラスポリマービーズなど）に共有結合している。このアプローチは最も強力な酵素/支持体相互作用を提供し、触媒作用中のタンパク質漏出を最小限に抑えます。^[10]
共有結合した酵素の活性は、キャリア材料の形状や大きさ、結合方法の種類、キャリア材料の組成や結合条件など、いくつかの要因に依存します。^[11]

アフィニティータグ結合：物理的方法と化学的方法を組み合わせた固定化法で、非共有結合または共有結合タンパク質タグを使用して、酵素を多孔質材料などの表面に固定化することができます。この技術はタンパク質精製の目的で確立されています。この技術は一般的に適用可能であり、事前の酵素精製なしで実行でき、結果として純粋な調製物が得られます。多孔質ガラスとその誘導体が使用され、多孔質表面は、問題の酵素に合わせて疎水性の点で適応させることができます。^[9]

ランダムとサイト指向

バイオテクノロジー上重要な酵素の多くは、ランダムな多点結合により、さまざまな支持体（無機、有機、複合材料、ナノ材料）に固定化されている。しかし、ランダムな化学修飾による固定化では、タンパク質中に存在する複数の側鎖（アミノ、カルボキシル、チオールなど）が支持体に結合した不均一なタンパク質集団が生じ、活性部位への基質のアクセスが制限されるため、活性が低下する可能性がある。^[12]

対照的に、部位特異的酵素固定化では、活性部位から離れたタンパク質分子内の特定のアミノ酸（通常はN末端またはC末端）に支持体を結合することができます。この方法では、基質が活性部位に自由にアクセスできるため、最大限の酵素活性が維持されます。これらの戦略は主に化学的ですが、支持体と酵素上に官能基（タンパク質には存在しない）を生成するために、遺伝的および酵素的方法も必要になる場合があります。^[12]

SDCM法の選択は、酵素の種類（安定性の低い好冷性酵素、またはより安定した好熱性酵素）、酵素のpH安定性、試薬のN末端またはC末端の利用可能性、酵素末端による酵素活性の非干渉性、触媒アミノ酸残基の種類、試薬の入手可能性、価格、調製の容易さなど、多くの要因に依存します。たとえば、支持体と酵素上に補完的なクリック可能な官能基（アルキンとアジド）を生成することは、部位特異的化学修飾によって酵素を固定化する最も便利な方法の1つです。^[13]

基質固定化

固定化法と酵素を組み合わせたもう一つの広く使われている応用は、固定化された基質上での酵素反応である。このアプローチは酵素活性の分析を容易にし、例えば細胞壁上での酵素の働きを模倣する。^[14]

商用利用

固定化酵素は、コストを削減し、触媒反応の結果を改善するため、重要な用途があります。利点は次のとおりです。

利便性: 反応液中に溶解するタンパク質はごく微量なので、後処理ははるかに容易になります。反応が完了すると、反応混合物には通常、溶媒と反応生成物のみが含まれます。^[15]
経済: 固定化された酵素は反応から簡単に除去できるため、生体触媒のリサイクルが容易になります。これは、ラクトースフリーミルクの製造などのプロセスで特に有用です。なぜなら、容器からミルクを排出しても、内部の酵素（ラクターゼ）は次のバッチのために準備できるからです。^[15]
安定性: 固定化酵素は、通常、可溶性酵素よりも熱安定性と操作安定性に優れています。 ^[15]

かつて、生物学的洗剤や洗剤には、汚れを分解するプロテアーゼやリパーゼが数多く含まれていました。しかし、洗浄剤が人間の皮膚に触れると、アレルギー反応を引き起こしました。そのため、多くの応用分野では、酵素の固定化が重要になります。

固定化酵素は、食品、化学、製薬、医療業界など、さまざまな用途に使用されています。例えば、食品業界では、固定化酵素は数種類のゼロカロリー甘味料の製造に使用されています。例えば、アルロースはフルクトースのエピマーであり、構造が異なるため、摂取しても人体に吸収されません。固定化酵素ベースの甘味料の別の例としては、タガトース（固定化β-ガラクトシダーゼ）があります。^[16]

化学（化粧品）業界でも、固定化酵素は、固定化CalB酵素を利用してエモリエントエステルの製造に使用されています。この方法を使用した最初の企業は、 2000年のエボニック社です。固定化された酵素リパーゼCalBは、実際にはオダナカチブやソホスブビルの製造など、他の医薬品用途にも使用されています。^[16]

参考文献

^ Zaushitsyna O、 Berillo D、Kirsebom H 、Mattiasson B (2013)。「バイオリアクター用途に適したモノリスを形成する低温構造化および架橋生細胞」。触媒トピックス。57 (5): 339–348。doi :10.1007/s11244-013-0189-9。S2CID 94773366。
^ Börner RA、Zaushitsyna O、Berillo D、Scaccia N、Mattiasson B、Kirsebom H (2014)。「ブタノール生産のためのクライオゲル化によるマクロ多孔性凝集体としてのClostridium acetobutylicum DSM 792の固定化」。プロセス生化学。49 :10–18。doi : 10.1016/j.procbio.2013.09.027 。
^ abcd Fessner WD (1999). 生体触媒：発見から応用まで。ベルリン：Springer。ISBN 3-540-64942-5. OCLC 40551838.
^ Zhang DH、Yuwen LX、Peng LJ ( 2013)。「固定化酵素の性能に影響を与えるパラメータ」。Journal of Chemistry。2013 : 1–7。doi : 10.1155/2013/ 946248。ISSN 2090-9063 。
^ ゼリンスキー T、ヴァルドマン H (1997-04-04)。「Quervernetzte Enzymkristalle (CLECs) — 医薬品有機化学のための効率的で安定した生物触媒」。アンゲヴァンテ・ケミー（ドイツ語）。109 (7): 746–748。Bibcode :1997AngCh.109..746Z。土井：10.1002/ange.19971090709。
^ abcde Mohamad NR、Marzuki NH、Buang NA、Huyop F、Wahab RA (2015 年 3 月)。「酵素の固定化技術と固定化酵素の表面分析技術の概要」。バイオテクノロジー、バイオテクノロジー機器。29 (2): 205–220。doi :10.1080/13102818.2015.1008192。PMC 4434042。PMID 26019635。
^ Brodelius P, Mosbach K (1987). 「[14] 概要」. Methods in Enzymology. Vol. 135. Elsevier. pp. 173–175. doi :10.1016/0076-6879(87)35075-x. ISBN 9780121820350. 2022年12月28日閲覧。
^ ab Buchholz K, Klein J (1987). 「[1] 固定化生体触媒の特性」.固定化生体触媒の特性. Methods in Enzymology. Vol. 135. Elsevier. pp. 3–30. doi :10.1016/0076-6879(87)35062-1. ISBN 9780121820350. PMID 3600301。
^ ab Engelmark Cassimjee K、Kadow M、Wikmark Y、Svedendahl Humble M、Rothstein ML、Rothstein DM、Bäckvall JE (2014 年 8 月)。「制御された多孔性ガラスでの一般的なタンパク質精製および固定化方法: 生体触媒への応用」。Chemical Communications。50 ( 65 ) : 9134–9137。doi :10.1039/C4CC02605E。PMID 24989793 。
^ Zucca P、Sanjust E (2014年9月)。「共有結合酵素固定化のための支持体としての無機材料：方法とメカニズム」。分子。19 (9): 14139–14194。doi : 10.3390/ molecules190914139。PMC 6272024。PMID 25207718。
^ 「弱結合ポーラロン：キャリア誘起軟化」、ポーラロン、ケンブリッジ大学出版、pp. 13–20、2012-11-29、doi :10.1017/cbo9781139023436.005、ISBN 9781139023436、2022-12-28取得
^ ab Margesin R (2017-06-22). Psychrophiles: From biodiversity to biotechnology (Second ed.). シャム、スイス: Springer. ISBN 978-3-319-57057-0. OCLC 991854426.
^ Shemsi AM、Khanday FA、Qurashi A、Khalil A、Guerriero G、Siddiqui KS (2019年5月)。「部位特異的化学修飾磁性酵素：製造、改良、バイオテクノロジーへの応用、将来の展望」。バイオテクノロジー の進歩。37 (3):357–381。doi :10.1016/j.biotechadv.2019.02.002。PMID 30768953。S2CID 73473772 。
^ Gray CJ、Weissenborn MJ 、Eyers CE 、 Flitsch SL（2013年8月）。「固定化基質上の酵素反応」。Chemical Society Reviews。42（15）：6378–6405。doi ：10.1039/C3CS60018A。PMID 23579870。
^ abc Wu H、Liang Y、Shi J 、 Wang X、Yang D、Jiang Z (2013 年 4 月)。「官能化チタン酸サブマイクロスフィア上に共有結合で固定化されたカタラーゼの安定性の向上」。材料科学と工学。C、生物学的応用のための材料。33 (3): 1438–1445。doi : 10.1016/ j.msec.2012.12.048。PMID 23827593。
^ ab Basso, Alessandra; Serban, Simona (2020), Guisan, Jose M.; Bolivar, Juan M.; López-Gallego, Fernando; Rocha-Martín, Javier (eds.)、「製薬、化学、食品産業における固定化酵素の応用の概要」、酵素と細胞の固定化、分子生物学の方法、vol. 2100、ニューヨーク、NY：Springer US、pp. 27–63、doi：10.1007/978-1-0716-0215-7_2、ISBN 978-1-0716-0214-0、PMID 31939114、S2CID 210826633 、 2023年1月9日取得

[Zaushitsyna2014-1] ^ Zaushitsyna O、 Berillo D、Kirsebom H 、Mattiasson B (2013)。「バイオリアクター用途に適したモノリスを形成する低温構造化および架橋生細胞」。触媒トピックス。57 (5): 339–348。doi :10.1007/s11244-013-0189-9。S2CID 94773366。

[Börner2014-2] Börner RA、Zaushitsyna O、Berillo D、Scaccia N、Mattiasson B、Kirsebom H (2014)。「ブタノール生産のためのクライオゲル化によるマクロ多孔性凝集体としてのClostridium acetobutylicum DSM 792の固定化」。プロセス生化学。49 :10–18。doi : 10.1016/j.procbio.2013.09.027 。

[:0-3] Fessner WD (1999). 生体触媒：発見から応用まで。ベルリン：Springer。ISBN 3-540-64942-5. OCLC 40551838.

[4] ^ Zhang DH、Yuwen LX、Peng LJ ( 2013)。「固定化酵素の性能に影響を与えるパラメータ」。Journal of Chemistry。2013 : 1–7。doi : 10.1155/2013/ 946248。ISSN 2090-9063 。

[5] ゼリンスキー T、ヴァルドマン H (1997-04-04)。「Quervernetzte Enzymkristalle (CLECs) — 医薬品有機化学のための効率的で安定した生物触媒」。アンゲヴァンテ・ケミー（ドイツ語）。109 (7): 746–748。Bibcode :1997AngCh.109..746Z。土井：10.1002/ange.19971090709。

[:1-6] Mohamad NR、Marzuki NH、Buang NA、Huyop F、Wahab RA (2015 年 3 月)。「酵素の固定化技術と固定化酵素の表面分析技術の概要」。バイオテクノロジー、バイオテクノロジー機器。29 (2): 205–220。doi :10.1080/13102818.2015.1008192。PMC 4434042。PMID 26019635。

[7] Brodelius P, Mosbach K (1987). 「[14] 概要」. Methods in Enzymology. Vol. 135. Elsevier. pp. 173–175. doi :10.1016/0076-6879(87)35075-x. ISBN 9780121820350. 2022年12月28日閲覧。

[:2-8] Buchholz K, Klein J (1987). 「[1] 固定化生体触媒の特性」.固定化生体触媒の特性. Methods in Enzymology. Vol. 135. Elsevier. pp. 3–30. doi :10.1016/0076-6879(87)35062-1. ISBN 9780121820350. PMID 3600301。

[Cassimjee2014-9] Engelmark Cassimjee K、Kadow M、Wikmark Y、Svedendahl Humble M、Rothstein ML、Rothstein DM、Bäckvall JE (2014 年 8 月)。「制御された多孔性ガラスでの一般的なタンパク質精製および固定化方法: 生体触媒への応用」。Chemical Communications。50 ( 65 ) : 9134–9137。doi :10.1039/C4CC02605E。PMID 24989793 。

[10] Zucca P、Sanjust E (2014年9月)。「共有結合酵素固定化のための支持体としての無機材料：方法とメカニズム」。分子。19 (9): 14139–14194。doi : 10.3390/ molecules190914139。PMC 6272024。PMID 25207718。

[11] 「弱結合ポーラロン：キャリア誘起軟化」、ポーラロン、ケンブリッジ大学出版、pp. 13–20、2012-11-29、doi :10.1017/cbo9781139023436.005、ISBN 9781139023436、2022-12-28取得

[:3-12] Margesin R (2017-06-22). Psychrophiles: From biodiversity to biotechnology (Second ed.). シャム、スイス: Springer. ISBN 978-3-319-57057-0. OCLC 991854426.

[13] Shemsi AM、Khanday FA、Qurashi A、Khalil A、Guerriero G、Siddiqui KS (2019年5月)。「部位特異的化学修飾磁性酵素：製造、改良、バイオテクノロジーへの応用、将来の展望」。バイオテクノロジー の進歩。37 (3):357–381。doi :10.1016/j.biotechadv.2019.02.002。PMID 30768953。S2CID 73473772 。

[Gray2013-14] ^ Gray CJ、Weissenborn MJ 、Eyers CE 、 Flitsch SL（2013年8月）。「固定化基質上の酵素反応」。Chemical Society Reviews。42（15）：6378–6405。doi ：10.1039/C3CS60018A。PMID 23579870。

[:4-15] Wu H、Liang Y、Shi J 、 Wang X、Yang D、Jiang Z (2013 年 4 月)。「官能化チタン酸サブマイクロスフィア上に共有結合で固定化されたカタラーゼの安定性の向上」。材料科学と工学。C、生物学的応用のための材料。33 (3): 1438–1445。doi : 10.1016/ j.msec.2012.12.048。PMID 23827593。

[:5-16] Basso, Alessandra; Serban, Simona (2020), Guisan, Jose M.; Bolivar, Juan M.; López-Gallego, Fernando; Rocha-Martín, Javier (eds.)、「製薬、化学、食品産業における固定化酵素の応用の概要」、酵素と細胞の固定化、分子生物学の方法、vol. 2100、ニューヨーク、NY：Springer US、pp. 27–63、doi：10.1007/978-1-0716-0215-7_2、ISBN 978-1-0716-0214-0、PMID 31939114、S2CID 210826633 、 2023年1月9日取得