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高性能液体クロマトグラフィー（HPLC ）は、以前は高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれていましたが、分析化学におけるクロマトグラフィー技術であり、混合物中の特定の成分（分析対象物）を分離、同定、定量するために使用されます。混合物は、食品、化学物質、医薬品[ 1 ]、生物、環境、農業などから発生する可能性があり、分析対象のサンプルは液体であるか、液体に溶解されています[ 2 ] 。
HPLCは基本的にカラムクロマトグラフィーの加圧版であり、重力の代わりに加圧ポンプを使用し、より細く長いカラムとより小さな吸着剤粒子を用いることで、分析分解能を高めている。
HPLCは、製造（例えば、医薬品や生物学的製品の製造工程中）、[ 3 ] [ 4 ]法務（例えば、尿中のパフォーマンス向上薬の検出）、[ 5 ]研究（例えば、複雑な生物学的サンプルの成分、または類似の合成化学物質を互いに分離する）、および医療（例えば、血清中のビタミンDレベルの検出）の目的で広く使用されています。[ 6 ]
高圧ポンプは、さまざまな溶媒の混合物（移動相、例えば水、緩衝液、アセトニトリル、メタノールなど）をサンプル混合物に通し、分析対象物をピックアップして、それをシリンダー（クロマトグラフィーカラム）に送り込みます。カラムには、吸着材（固定相）でできた固体粒子が充填されています。粒子は通常、シリカ、ポリマーでできており、直径は 1.5～50 μm です。[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]移動相が固定相を通過すると溶出が起こります。サンプル中の各成分は、吸着材と溶媒と異なる相互作用をするため、溶出速度が異なります。[ 2 ]これらの異なる速度により、カラムから流れ出る流体（溶出液）中の成分が分析的に分離されます。溶出液は、 UV 検出器などの特定のクロマトグラフィー検出器に入り、グラフ（クロマトグラム）が生成されます。クロマトグラムは、検出器信号強度と時間または移動相の体積との関係を示すグラフです。分析対象物が十分に分離されている場合、クロマトグラムには分析対象物ごとに1つの、十分に分離されたピークが現れます。各分析対象物は、それぞれの時間（保持時間）に現れ、その面積はその量に比例します。[ 7 ]
クロマトグラフィーは、吸着および/または分配を伴う物質移動プロセスとして説明できます。前述のように、HPLCはポンプを使用して加圧された液体とサンプル混合物を吸着剤（カラムの活性成分）が充填されたカラムに通します。一部の分析対象物は溶出液よりも吸着剤に強く付着する可能性があり、他の分析対象物はその逆の場合があります。つまり、分析対象物は異なる分配係数を持つ可能性があり、その結果、分析対象物が分離されます。分析対象物、固相、および液相間の相互作用は、物理的または化学的に可逆であり、通常は非共有結合相互作用の組み合わせです。[ 10 ] [ 11 ]
液体クロマトグラフは複雑で[ 12 ]、高度で繊細な技術が用いられています。システムを適切に操作するためには、誤ったデータや歪んだ結果を避けるために、装置がどのようにデータ処理を行うかについて最低限の理解が必要です。[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]
HPLCは、操作圧力が著しく高い（約50～1400 bar）という点で、従来の（「低圧」）液体クロマトグラフィーとは区別されます。通常の液体クロマトグラフィーでは、移動相を充填カラムに通すのに重力に頼っています。分析用HPLCでは分離するサンプル量が少ないため、一般的なカラムの寸法は 直径2.1～4.6 mm、 長さ30～250 mmです。また、HPLCカラムはより小さな吸着剤粒子（平均粒子サイズ1.5～50 μm）で作られています。これにより、HPLCは混合物をより短い時間で分離する際に優れた分離能（化合物を区別する能力）を発揮し、人気の高いクロマトグラフィー技術となっています。[ 16 ]
HPLC装置の概略図は、一般的に溶媒リザーバー、1つ以上のポンプ、溶媒脱気装置、サンプラー、カラム、および検出器から構成されます。溶媒は分離の要件に応じて事前に準備され、脱気装置を通過して溶存ガスを除去した後、混合されて移動相となり、サンプラーを通過します。サンプラーはサンプル混合物を移動相の流れに取り込み、移動相はそれをカラムに運びます。ポンプは、カラム内の固定相を通して所望の流量と組成の移動相を送り込み、検出器内のフローセルに直接送り込みます。検出器は、カラムから出てくるサンプル成分の量に比例した信号を生成するため、サンプル成分の定量分析が可能になります。検出器はまた、成分の初期同定に役立つ、出現時間、すなわち保持時間も記録します。より高度な検出器は、UV-VISスペクトルや質量スペクトルなど、分析対象物の特性に特有の追加情報も提供し、その構造的特徴に関する知見を得ることができます。これらの検出器は、UV/Vis、フォトダイオードアレイ（PDA）/ダイオードアレイ検出器、質量分析検出器など、一般的に使用されています。[ 17 ] [ 18 ]
デジタルマイクロプロセッサとユーザーソフトウェアがHPLC装置を制御し、データ解析を行います。HPLC装置に搭載されている機械式ポンプの中には、複数の溶媒を時間とともに変化する比率で混合し、移動相に組成勾配を生成できるものもあります。最新のHPLC装置には、分離を行う温度を調整できるカラムオーブンが搭載されています。[ 19 ]
分離・分析対象となる試料混合物は、少量（通常はマイクロリットル）でカラム内を流れる移動相の流れに導入されます。試料の各成分は、吸着剤（固定相）との特定の物理的相互作用によって異なる速度でカラム内を移動します。各成分の速度は、その化学的性質、固定相（カラム内部）の性質、および移動相の組成に依存します。特定の分析対象物質が溶出（カラムから出てくる）する時間を、その物質の保持時間と呼びます。特定の条件下で測定された保持時間は、特定の分析対象物質を識別するための特性となります。
粒子サイズ、多孔性、表面化学特性が異なる吸着剤を充填した、様々な種類のカラムが市販されている。粒子サイズの小さい充填材を使用すると、より高い操作圧力（「背圧」）が必要となり、一般的にクロマトグラフィーの分離度（カラムから連続して溶出する分析対象物間のピーク分離度）が向上する。吸着剤粒子は、イオン性、疎水性、または極性のいずれかの性質を持つ。
液体クロマトグラフィーで最も一般的な方法は逆相クロマトグラフィーであり、移動相には水または緩衝液と様々な有機溶媒（最も一般的なのはアセトニトリルとメタノール）の混和性の組み合わせが用いられます。一部のHPLC法では、水を含まない移動相が使用されます（下記の順相クロマトグラフィーを参照）。移動相の水性成分には、試料成分の分離を促進するために、酸（ギ酸、リン酸、トリフルオロ酢酸など）または塩が含まれる場合があります。クロマトグラフィー分析中、移動相の組成は一定に保たれる場合（「等濃度溶出モード」）と、変化する場合（「グラジエント溶出モード」）があります。等濃度溶出は、単純な混合物の分離に一般的に有効です。グラジエント溶出は、固定相および移動相との相互作用が変化する複雑な混合物に必要です。これが、グラジエント溶出において移動相の組成が、通常、溶出強度が低いものから高いものへと変化する理由です。移動相の溶出強度は分析対象物の保持時間に反映され、溶出強度が高いほど溶出が速くなり（結果として保持時間が短縮される）、分析対象物の保持時間に反映されます。例えば、逆相クロマトグラフィーにおける典型的なグラジエントプロファイルは、5%アセトニトリル（水または水性緩衝液中）から始まり、5～25分かけて直線的に95%アセトニトリルまで上昇します。グラジエントプロファイルには、移動相組成が一定の期間（プラトー）が含まれる場合もあります。例えば、移動相組成を1～3分間5%アセトニトリルで一定に保ち、その後直線的に95%アセトニトリルまで上昇させる、といった場合です。
移動相の組成は、様々な試料成分（「分析対象物」）と固定相との相互作用の強さ（例えば、逆相HPLCにおける疎水性相互作用）によって決まります。分析対象物は、固定相と移動相への親和性に応じて、カラム内で行われる分離プロセス中に両相間で分配されます。この分配プロセスは、液液抽出で起こる分配プロセスと似ていますが、段階的ではなく連続的に行われます。
水/アセトニトリル勾配を用いた例では、疎水性の高い成分は後から溶出（カラムから溶出）し、その後、移動相中のアセトニトリル濃度が高くなると（つまり、移動相中の溶出液濃度が高くなると）、溶出速度が速くなります。
移動相成分、添加剤（塩や酸など）、およびグラジエント条件の選択は、カラムと試料成分の性質によって異なります。多くの場合、適切な分離が得られるHPLC法を見つけるために、試料を用いて一連の試運転が行われます。
HPLC 以前は、科学者は卓上カラム液体クロマトグラフィー技術を使用していました。液体クロマトグラフィーシステムは、溶媒の流量が重力に依存するため、効率が非常に悪かった。分離には数時間、場合によっては数日かかりました。当時のガスクロマトグラフィー(GC) は液体クロマトグラフィー(LC) よりも強力でしたが、極性の高い高分子量生体高分子の気相分離と分析は不可能であることは明らかでした。[ 20 ] GC は、生体分子の多くの生命科学および健康アプリケーションには効果的ではありませんでした。なぜなら、生体分子はほとんどが不揮発性で、 GC の高温で熱的に不安定だからです。[ 21 ]その結果、代替方法が仮説として立てられ、まもなく HPLC の開発につながりました。
1941 年の Martin と Synge の先駆的な研究に続いて、 1960 年代にはCalvin Giddings [ 22 ]、Josef Huber らが、充填粒子径を一般的な 150 μm より大幅に小さくし、圧力を利用して移動相の速度を上げることで、LC を高効率モードで操作できると予測した。[ 20 ]これらの予測は、60 年代から 70 年代にかけて、今日に至るまで、広範な実験と改良が行われた。[ 23 ]初期の開発研究では、例えば表面多孔質粒子である歴史的な Zipax など、LC 粒子の改良が始まった。[ 24 ]
1970年代には、ハードウェアと計測機器において多くの発展が見られました。研究者たちは、ポンプとインジェクターを使用して、HPLCシステムの基本的な設計を始めました。[ 25 ]ガスアンプリファイアポンプは、一定圧力で動作し、安定した流量と良好な定量のために漏れのないシールやチェックバルブを必要としないため、理想的でした。[ 21 ]デュポンIPD（工業用ポリマー部門）では、低滞留容量グラジエントデバイスの使用や、セプタムインジェクターをループインジェクションバルブに置き換えるなど、ハードウェアのマイルストーンが達成されました。[ 21 ]
計測機器の開発も重要でしたが、HPLCの歴史は主に粒子技術の歴史と進化に関するものです。[ 21 ] [ 26 ]多孔質層粒子の導入後、効率を向上させるために粒子サイズを小さくする傾向が着実に続いています。[ 21 ]しかし、粒子サイズを小さくすると、新たな問題が発生しました。実用上の欠点は、移動流体をカラムに通すために必要な過剰な圧力降下と、非常に細かい材料の均一な充填を準備することの難しさに起因します。[ 27 ]粒子サイズが大幅に小さくなるたびに、圧力に対応するために、通常は別の計測機器の開発が必要になります。[ 23 ] [ 21 ]
分配クロマトグラフィーは、化学者が開発した最初のクロマトグラフィーの一種であり、今日ではほとんど使用されていません。[ 28 ]分配係数の原理は、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気相および液液分離アプリケーションに適用されています。1952年のノーベル化学賞は、アミノ酸の分離に使用されたこの技術の開発により、アーチャー・ジョン・ポーター・マーティンとリチャード・ローレンス・ミリントン・シンジによって受賞されました。[ 29 ]分配クロマトグラフィーは、ペーパークロマトグラフィーと同様に、「不活性」固体支持マトリックスの表面または粒子または繊維内に保持された溶媒を使用するか、または固定相とのクーロン相互作用および/または水素供与体相互作用を利用します。分析対象分子は、液体固定相と溶出液の間で分配されます。親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC; HPLC内のサブテクニック）と同様に、この方法は極性の違いに基づいて分析対象を分離します。 HILICでは、結合極性固定相と、主にアセトニトリルと水を主成分とする移動相が最もよく使用されます。分配HPLCは、歴史的に非結合シリカまたはアルミナ担体で使用されてきました。どちらも相対的な極性の違いによって分析対象物を分離するのに効果的です。HILIC結合相は、酸性、塩基性、中性の溶質を単一のクロマトグラフィー実行で分離できるという利点があります。[ 30 ]
極性分析物は、極性固定相に関連する静止水層に拡散し、保持されます。極性分析物と極性固定相（移動相に対する相対的な）との相互作用が強いほど、溶出時間は長くなります。相互作用の強さは、分析物の分子構造を構成する官能基に依存し、より極性のある基（例えば、ヒドロキシル基）や水素結合を形成できる基ほど保持時間が長くなります。クーロン（静電）相互作用も保持時間を増加させる可能性があります。移動相に極性溶媒を使用すると分析物の保持時間は短くなりますが、疎水性溶媒を使用すると保持時間は長くなる傾向があります。
順相クロマトグラフィーは、化学者が開発した最初のHPLCの一種ですが、ここ数十年で使用頻度が減少しています。順相HPLC（NP-HPLC）とも呼ばれるこの方法は、シリカなどの極性固定相表面への親和性に基づいて分析対象物を分離します。つまり、分析対象物が吸着剤表面と極性相互作用（水素結合や双極子-双極子相互作用など）を起こす能力に基づいています。NP-HPLCは非極性、非水の移動相（例えばクロロホルム）を使用し、非極性溶媒に容易に溶解する分析対象物の分離に効果的です。分析対象物は極性固定相と結合し、保持されます。吸着強度は分析対象物の極性の増加とともに増加します。相互作用の強度は、分析対象分子の構造中に存在する官能基だけでなく、立体因子にも依存します。立体障害が相互作用強度に及ぼす影響により、この方法では構造異性体を分離することができます。
移動相に極性の高い溶媒を使用すると分析対象物の保持時間が短くなる一方、疎水性の高い溶媒を使用すると溶出が遅くなる（保持時間が長くなる）傾向があります。移動相中の微量の水などの極性の高い溶媒は、固定相の固体表面に吸着して固定結合（水）層を形成し、これが保持に重要な役割を果たすと考えられています。この挙動は、ほぼ完全に吸着機構によって制御される順相クロマトグラフィーに特有のものです（つまり、分析対象物は吸着剤表面に結合したリガンドの溶媒和層ではなく、固体表面と相互作用します。後述の逆相HPLCも参照）。吸着クロマトグラフィーは、活性（乾燥）シリカまたはアルミナ担体を用いたカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーの両方の形式で、構造異性体の分離に今でも使用されています。
分配型HPLCおよびNP-HPLCは、シリカまたはアルミナのクロマトグラフィー媒体の表面に水またはプロトン性有機溶媒の層が存在するため、保持時間の再現性が低く、逆相HPLCの開発に伴い、1970年代に廃れていった。この層は移動相の組成（例えば、水分量）の変化によって変化し、保持時間の変動を引き起こす。
近年、再現性が向上したHilic結合相の開発や、この技術の有用性の範囲に対する理解の深化により、分配クロマトグラフィーが再び人気を集めている。
置換クロマトグラフィーの使用はかなり限られており、主に分取クロマトグラフィーに使用されます。基本原理は、クロマトグラフィーマトリックスに対する高い親和性を持つ分子（置換剤）が結合部位を効果的に競合し、親和性の低いすべての分子を置換することに基づいています。[ 31 ] 置換クロマトグラフィーと溶出クロマトグラフィーには明確な違いがあります。溶出モードでは、物質は通常、狭いガウス型のピークとしてカラムから出てきます。最大限の精製を達成するには、ピークの広い分離、できればベースラインまで分離することが望まれます。溶出モードで混合物の成分がカラムを下る速度は、多くの要因に依存します。しかし、2つの物質が異なる速度で移動し、それによって分離されるためには、生体分子とクロマトグラフィーマトリックス間の何らかの相互作用に大きな違いがなければなりません。この違いの効果を最大化するために、操作パラメータが調整されます。多くの場合、ピークのベースライン分離は、グラジエント溶出と低いカラム負荷によってのみ達成できます。したがって、溶出モードクロマトグラフィー、特に分取スケールにおける2つの欠点は、グラジエント溶媒ポンプによる操作の複雑さと、カラム負荷量の少なさによるスループットの低さである。置換クロマトグラフィーは、成分が「ピーク」ではなく純物質の連続ゾーンに分離されるという点で、溶出クロマトグラフィーよりも優れている。このプロセスは等温線の非線形性を利用するため、1つのカラムでより多くのカラム供給量を分離でき、精製された成分をはるかに高い濃度で回収できる。
逆相HPLC（RP-HPLC）[ 32 ]は、最も広く普及しているクロマトグラフィー法です。非極性の固定相と、水性で中程度の極性の移動相を備えています。RP-HPLCは生物学者や生命科学分野のユーザーの間で非常に一般的に使用されているため、単に「HPLC」と呼ばれることもよくあります。製薬業界も、医薬品の発売前に品質評価を行うためにRP-HPLCを定期的に使用しています。
逆相法では、物質の疎水性が高いほど、その物質は系内に保持されます。有機物質の保持には、固定相は主にカラムに充填されたシリカゲルの多孔質顆粒から構成されます。形状は通常、直径（2、3、5、7、10 μm未満）と細孔径（60、100、150、300 Å）が異なる球状です。その表面には、C3、C4、C8、C18などの直鎖アルキル配位子が化学的に結合しています。数字は配位子中の炭素原子の数を表します。例えば、C3配位子はプロピル基です。固定相上の炭化水素配位子が長いほど、試料成分の保持時間が長くなります。現在、生体医療物質の分離法のほとんどでは、C18固定相が使用されており、ODS（オクタデシルシラン）やRP-18（逆相18）などの商品名で呼ばれることもあります。このような固定相を作るには、シリカゲル粒子の表面をRMe 2 SiClで処理します。ここでRはC 18 H 37やC 8 H 17のような直鎖アルキル基です。
芳香族化合物、あるいは一般的にπ結合を多く持つ化合物を分離するために、固定相にフェニル表面配位子を用いることができる。
pHが2未満の場合、配位子とシリカゲルの結合が溶解する可能性がある。pHが8を超える場合、シリカ自体が溶解する可能性がある。極端なpHの溶液が必要な場合は、固定相を有機物質で重合させたシリカ、または疎水性有機ポリマーで構成することができる。
このような固定相では、非極性分子の保持時間は長くなり、極性分子はより容易に溶出する（分析の初期段階で出現する）。クロマトグラフィー分析者は、移動相に水を加えることで保持時間を長くすることができる。水は極性が高いため、非極性分析対象物質と非極性固定相との相互作用が強くなる。同様に、研究者は、移動相に有機非極性溶媒を加えることで保持時間を短くすることができる。
RP-HPLCは疎水性相互作用の原理に基づいており、これは双極性水構造の高い対称性に由来し、生命科学におけるすべてのプロセスにおいて最も重要な役割を果たします。RP-HPLCはこれらの相互作用力の測定を可能にします。分析対象物の固定相への結合は、固定相上のリガンドとの結合時に分析対象物分子の非極性セグメントの周囲の接触表面積に比例します。この溶媒疎水性効果は、分析対象物とC18鎖の周囲の「空洞縮小」に対する水の力と、両者の複合体に対する水の力によって支配されます。このプロセスで放出されるエネルギーは、溶出液の表面張力（水：7.3 × 10 −6 J /cm 2、メタノール：2.2 × 10 −6 J/cm 2）と、それぞれ分析対象物とリガンドの疎水性表面に比例します。移動相に極性の低い溶媒（メタノール、アセトニトリルなど）を添加して水の表面張力を低下させることで、保持時間を短縮することができます。グラジエント溶出法はこの効果を利用し、分析中に水性移動相の極性と表面張力を自動的に低下させます。
分析対象分子の構造特性は、その保持特性に重要な役割を果たす可能性があります。理論的には、疎水性表面積が大きい分析対象分子（C–H、C–C、および一般的にSSなどの非極性原子結合）は、水構造と相互作用しないため、より長く保持されます。一方、極性表面積が大きい分析対象分子（構造中に-OH、-NH₂、COO⁻、または-NH₃⁺などの極性基が存在するため）は、水に溶け込みやすいため、保持時間は短くなります。固定相との相互作用は、立体障害効果、または排除効果によっても影響を受ける可能性があります。これは、非常に大きな分子の成分が、表面リガンド（アルキル鎖）との相互作用が起こる固定相の細孔へのアクセスが制限されることを意味します。このような表面障害は、通常、保持時間の短縮につながります。
分子の疎水性（非極性）表面積が大きくなるにつれて、保持時間は長くなります。例えば、分岐鎖化合物は、対応する直鎖異性体よりも表面積が小さいため、より速く溶出することがあります。同様に、単結合のC–Cを持つ有機化合物は、二重結合や三重結合を持つ化合物よりも分子がコンパクトになるため、C=C結合やC≡C結合を持つ化合物よりも溶出が遅くなることがよくあります。
もう一つの重要な要素は移動相のpHです。移動相のpHはイオン化可能な分析対象物の疎水性を変化させる可能性があるためです。このため、ほとんどの方法ではリン酸ナトリウムなどの緩衝剤を使用してpHを制御します。pHと緩衝剤の制御による効果は用途によって異なりますが、一般的にイオン化可能な分析対象物のクロマトグラフィー分離能が向上します。緩衝剤には複数の目的があります。
溶出液を質量分析法で分析する場合、酢酸やギ酸などの揮発性有機酸が溶出液に添加されることが多い。ギ酸アンモニウムは、分析対象物とアンモニウムの付加物を形成することで、特定の分析対象物の検出感度を向上させるために一般的に添加される。この付加物は、分析対象物自体よりも揮発性が高い。
トリフルオロ酢酸（TFA）は、主にUV検出器を用いたバイオメディカルサンプル（主にペプチドやタンパク質）の複雑な混合物の分析において、移動相添加剤として広く用いられています。TFAは比較的強い有機酸であるため、UV-VISなどの他の検出器を用いた分析においても、カルボン酸などの分析対象物の保持時間を増加させます。しかしながら、TFAは検出器や溶媒送液系に残留物を残し、分析や検出を妨げる可能性があるため、質量分析法ではほとんど使用されません。
逆相のシリカ粒子は、表面に結合した疎水性リガンドによって保護されているため、順相のシリカ粒子に比べて損傷を受けにくい。しかし、ほとんどの逆相カラムはアルキル誘導体化シリカ粒子で構成されており、酸性条件（pH < 2）ではシリカの加水分解が起こりやすい。また、シリカ自体もアルカリ性条件（pH > 8）では溶解する。極端なpH条件下でも使用できるハイブリッドまたは強化シリカベースの逆相カラム粒子の特定のブランドが存在する。非常に酸性の強い条件では、HPLC装置の金属部品が腐食する可能性もある。
原則として、ほとんどの場合、RP-HPLCカラムは使用後に残留酸や緩衝液を除去するためにきれいな溶媒で洗浄し、適切な組成の溶媒に保管する必要があります。一部の生物医学アプリケーションでは、最適な分離のために非金属環境が必要です。このような敏感なケースでは、カラムの金属含有量をテストする方法として、 2,2'-ビピリジンと4,4'-ビピリジンの混合物であるサンプルを注入する方法があります。2,2'-ビピリジンは金属をキレートできるため、シリカ表面に金属イオンが存在すると、2,2'-ビピリジンのピークの形状が歪みます（テーリングが発生します）。
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）[ 33 ]は、ポリマー分子と生体分子を分子サイズの違い（実際には粒子のストークス半径）に基づいて分離します。この分離プロセスは、サンプル分子がカラム内に充填されたゲル球の細孔を透過する能力に基づいており、分析対象分子の相対的なサイズと吸着剤のそれぞれの細孔サイズに依存します。このプロセスはまた、充填材表面との相互作用がないことにも依存しています。
SECには主に2つの種類があります。
SECにおける分離原理は、試料中の高分子量物質がカラムを通過する際に、多孔質の固定相粒子に完全に、または部分的に浸透することに基づいています。移動相溶出液は、固定相表面との相互作用を完全に防ぐように選択されます。このような条件下では、分子サイズが小さいほど、細孔空間への浸透性が高くなり、カラムを通過するのに時間がかかります。一方、分子サイズが大きいほど、分子が固定相の細孔に完全に浸透せず、細孔の周囲を移動する可能性が高くなり、結果として早く溶出されます。分子は分子量の降順で分離され、最も大きな分子が最初にカラムから溶出し、より小さな分子が後に溶出します。細孔サイズよりも大きな分子は細孔に全く入らず、クロマトグラムの最初のピークとして一緒に溶出します。これは全排除容量と呼ばれ、特定のカラムの排除限界を定義します。小分子は固定相粒子の細孔を完全に透過し、最後に溶出するため、クロマトグラムの終わりを示し、全浸透マーカーとして現れることがある。
生物医学分野では、一般的に低分解能クロマトグラフィーとみなされており、そのため精製の最終段階である「仕上げ」ステップに用いられることが多い。精製タンパク質の三次構造および四次構造の決定にも有用である。SECは主にタンパク質やポリマーなどの大きな分子の分析に用いられる。SECは、粒子の細孔に小さな分子を捕捉することで、分取法としても機能する。大きな分子は細孔に入るには大きすぎるため、そのまま通過する。したがって、大きな分子は小さな分子よりもカラム内を速く流れる。つまり、分子が小さいほど保持時間が長くなる。
この技術は多糖類の分子量測定に広く用いられています。SECは、市販されているさまざまな低分子量ヘパリンの分子量比較のための欧州薬局方の公式技術です。[ 34 ]
イオン交換クロマトグラフィー（IEC）またはイオンクロマトグラフィー（IC）[ 35 ]は、金属産業、産業廃水、生物系、医薬品サンプル、食品など、環境および産業由来の水性サンプル中のイオン性溶質の分離および定量のための分析技術です。
イオン交換クロマトグラフィー（IEC）では、固定相に電荷を帯びた部位が存在します。カラム上のイオンと同じ電荷を持つ溶質イオンは反発されて保持されずに溶出されますが、カラムの電荷部位と反対の電荷を持つ溶質イオンはカラムに保持されます。一般的に、電荷が大きく半径が小さいイオンほど強く保持されます。カラムに保持された溶質イオンは、移動相の組成（塩濃度やpHの上昇、固定相温度の上昇など）を変更することで溶出させることができます。
イオン交換体の種類には、ポリスチレン樹脂、セルロースおよびデキストランイオン交換体（ゲル）、制御細孔ガラスまたは多孔質シリカゲルなどがあります。ポリスチレン樹脂は架橋が可能で、これにより鎖の安定性が向上します。架橋度が高いほどスワービングが抑制され、平衡化時間が長くなり、最終的に選択性が向上します。セルロースおよびデキストランイオン交換体は、より大きな細孔サイズと低い電荷密度を持つため、タンパク質分離に適しています。
樹脂中の官能基に対する対イオン濃度が増加すると、溶質イオンとの競合が強くなるため、保持時間が短縮されます。陽イオン交換ではpHの低下が保持時間を短縮し、陰イオン交換ではpHの上昇が保持時間を短縮します。例えば、陽イオン交換カラム内の溶媒のpHを下げると、陰イオン固定相上の位置をめぐって競合する水素イオンが増加し、結合力の弱い陽イオンが溶出されます。
このクロマトグラフィー法は、水質浄化、微量成分の濃縮、配位子交換クロマトグラフィー、タンパク質のイオン交換クロマトグラフィー、炭水化物およびオリゴ糖の高pH陰イオン交換クロマトグラフィーなど、幅広い用途で利用されています。
高性能アフィニティークロマトグラフィー（HPAC）[ 36 ]は、固定化された生物活性リガンドを含む固定相を充填したカラムにサンプル溶液を通すことで機能します。リガンドは実際には、サンプル溶液中の標的分子に対して特異的な結合親和性を持つ基質です。標的分子はリガンドに結合しますが、サンプル溶液中の他の分子はカラムをほとんどまたは全く保持されずに通過します。その後、適切な溶出バッファーを使用して標的分子をカラムから溶出します。
このクロマトグラフィー法は、結合した活性物質が特定の試料成分を生物学的に認識することで、安定かつ特異的で可逆的な複合体を形成する能力に依存している。これらの複合体の形成には、ファンデルワールス力、静電相互作用、双極子-双極子相互作用、疎水性相互作用、水素結合といった一般的な分子間力が関与する。相補的な結合部位において、これらの力が複数同時に協調的に作用することで、効率的かつ特異的な結合が形成される。
水性順相クロマトグラフィー（ANP）は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）とも呼ばれます。[ 37 ]これは、逆相クロマトグラフィー（RP）と有機順相クロマトグラフィー（ONP）の間の移動相領域を包含するクロマトグラフィー技術です。HILICは、移動相に「逆相溶媒」、つまり比較的極性のある主に非水溶媒を使用することで、親水性化合物の独自の選択性を実現するために使用されます。[38]多くの生体分子、特に生体液中に存在するものは、逆相HPLCでは保持されにくい小さな極性化合物です。このため、親水性相互作用LC（HILIC）は、極性分子の分析のための魅力的な代替手段であり、有用なアプローチとなっています。さらに、HILICは、ACNやメタノールなどの極性有機溶媒を含む従来の水性混合物で日常的に使用されているため、MSと容易に結合できます。[ 38 ]
分離中、移動相の組成は同じままの場合もあれば、変化する場合もある。組成が同じままの場合、そのプロセスは等組成（組成が一定という意味）と呼ばれる。この用語は、HPLCの先駆者の一人であるCsaba Horvathによって造語された。 [ 39 ] [ 40 ]
変化する場合は、そのプロセスはグラジエント溶出と呼ばれます。[ 41 ] [ 42 ]例えば、グラジエントは水中のメタノール10%から始まり、20分後に水中のメタノール90%で終了することができます。移動相の2つの成分は通常「A」と「B」と呼ばれます。Aは溶質がゆっくりとしか溶出しない「弱い」溶媒であり、Bはカラムから溶質を急速に溶出させる「強い」溶媒です。逆相クロマトグラフィーでは、溶媒Aは多くの場合水または水性緩衝液であり、Bはアセトニトリル、メタノール、THF、またはイソプロパノールなどの水と混和する有機溶媒です。
等溶媒溶出では、ピーク幅は理論段数Nの式に従って保持時間とともに直線的に増加します。これは、保持係数の範囲が広い分析対象物を含むサンプルを分析する場合に大きな欠点となる可能性があります。弱い移動相を使用すると、ランタイムが長くなり、溶出の遅いピークが広がり、感度が低下します。強い移動相を使用すると、ランタイムと後続ピークの広がりに関する問題は改善されますが、ピーク分離が低下します。特に、溶出の速い分析対象物では、完全に分離するのに十分な時間がない場合があるため、この問題は顕著になります。この問題は、グラジエント溶出のように移動相組成を変化させることで解決されます。
グラジエント溶出では、弱い移動相から開始し、実行中に徐々に濃度を上げていくことで、後から溶出する成分の保持時間を短縮し、溶出速度を速めます。これにより、ほとんどの成分でより狭く（そしてより高く）なるピークが得られるとともに、先に溶出する成分も適切に分離できます。また、有機溶媒の濃度の上昇によってピークの末端部分が押し出されるため、テールのあるピークの形状も改善されます。さらに、ピークの高さも高くなり（ピークがよりシャープに見える）、これは微量分析において重要です。グラジエントプログラムには、有機成分の割合を急激に「段階的に」増加させたり、異なる時間で異なる傾斜を設定したりするなど、最適な分離を最短時間で実現するための様々な設定が可能です。
等溶媒溶出では、カラムの寸法（長さと内径）が変わっても保持順序は変わりません。つまり、ピークは同じ順序で溶出します。しかし、グラジエント溶出では、寸法や流量が変わると溶出順序が変わる可能性があります。寸法や流量が変化に応じて縮小または拡大されない場合[ 43 ]
逆相クロマトグラフィーにおける駆動力は、水の構造の高秩序性に由来する。移動相の有機成分の役割は、この高秩序性を低下させ、それによって水成分の保持力を弱めることである。
一般クロマトグラフィーの理論はHPLCにも適用されます。[ 44 ]この理論は、米国薬局方のシステム適合性試験の基礎となっており、[ 45 ] HPLCシステムが各ステップで必要な分析にどれだけ適しているかを定量的に評価する基準のセットです。
この関係は、保持係数または保持パラメータとして知られる正規化された無次元係数としても表され、これは性能基準図にも示されているように、容量比の実験的測定値です。t Rは特定の成分の保持時間であり、t 0は保持されない物質が保持されずにシステムを通過するのにかかる時間であるため、空隙時間と呼ばれます。
クロマトグラム上の隣接する2つのピークの保持係数k'の比は、それらの分離度を評価するために使用され、パフォーマンス基準グラフに示すように選択性係数αと呼ばれます。
システム効率の基準としての理論段数 N は、等溶媒条件、すなわち、実行全体を通して移動相組成が一定である条件で開発されました。クロマトグラフィーの実行中に移動相が時間とともに変化するグラジエント条件では、システム効率の尺度としてパラメータピーク容量P c を使用する方が適切です。 [ 46 ]クロマトグラフィーにおけるピーク容量の定義は、特定の事前定義された分離係数（通常は約 1）に対して保持ウィンドウ内で分離できるピークの数です。これは、ピークの平均幅の数で測定される実行時間と考えることもできます。式は、性能基準の図に示されています。この式では、tg はグラジエント時間、w(ave) はベースでの平均ピーク幅です。
これらのパラメータは、主に2つのクロマトグラフィー理論、すなわちプレート理論（分配クロマトグラフィーの一部）とクロマトグラフィーの速度論／ファン・デームテル方程式から導き出されます。もちろん、これらのパラメータはHPLCクロマトグラムの解析を通して実際に適用できますが、速度論の方がより正確な理論と考えられています。
これらは、ペーパークロマトグラフィー分離における保持係数の計算に類似していますが、HPLCが混合物をクロマトグラム上のピーク（バンド）として検出される2つ以上の成分にどれだけうまく分離できるかを表します。HPLCパラメータは、効率係数（N）、保持係数（κ'）、および分離係数（α）です。これらの係数は、2つの成分のピークがどれだけうまく分離または重なり合っているかを表す分離方程式の変数となります。これらのパラメータは、HPLC逆相分離とHPLC順相分離の説明に主に使用されます。これは、これらの分離が他のHPLCモード（イオン交換やサイズ排除など）よりも微妙な傾向があるためです。
ボイドボリュームとは、カラム内で溶媒が占める空間の量のことです。これは、カラム内部の充填材の外側の空間を指します。ボイドボリュームは、クロマトグラム上で最初に検出される成分ピークとして測定されます。これは通常、試料混合物中に存在していた溶媒です。理想的には、試料溶媒はカラムと相互作用することなくカラムを通過しますが、HPLC溶媒とは区別して検出可能です。ボイドボリュームは補正係数として使用されます。
効率係数（N）は、クロマトグラム上の成分ピークのシャープさを、成分ピークの面積（「保持時間」）とピークの最大幅（ベースライン）の比として表したものです。ピークが高く、シャープで、比較的狭い場合は、分離方法が混合物から成分を効率的に除去したことを示しています。つまり、効率が高いということです。効率は、使用するHPLCカラムとHPLCメソッドに大きく依存します。効率係数は、理論段数、すなわち「理論段数」と同義です。
保持係数（カッパプライム）は、混合物の成分がカラムに付着していた時間を測定するもので、クロマトグラムにおけるピークの曲線下の面積によって表されます（HPLCクロマトグラムは時間の関数であるため）。各クロマトグラムピークにはそれぞれ固有の保持係数があります（例えば、最初のピークの保持係数はカッパ1）。この係数は、カラムの空隙容量によって補正される場合があります。
分離係数（アルファ）は、混合物の隣接する2つの成分（すなわち、クロマトグラム上の隣接する2つのバンド）がどの程度分離されているかを示す相対的な比較です。この係数は、隣接する2つのクロマトグラムピークの保持係数の比で定義され、カラムのボイドボリュームによって補正される場合もあります。分離係数の値が1.0を超えるほど分離は良好ですが、約2.0を超えると、おそらくHPLC法による分離は不要になります。分離度方程式は、これら3つの係数を関連付けており、高い効率と分離係数によって、HPLC分離における成分ピークの分離度が向上します。
HPLCカラムの内径（ID）は重要なパラメータです。[ 47 ]溶質バンドの横方向拡散が減少するため、内径が小さくなると検出応答に影響を与える可能性があります。また、等濃度モードとグラジエントモードの両方で、使用する内径の小ささや大きさに比例して流量と注入量が縮小または拡大されない場合、分離選択性にも影響を与える可能性があります。[ 48 ]カラムにロードできる分析対象物の量を決定します。内径の大きいカラムは通常、医薬品を後で使用するために精製するなどの分取アプリケーションで見られます。[ 49 ]最近の超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）では、低IDカラムは感度が向上し、溶媒消費量が少なくなっています。[ 50 ]
内径の大きいカラム（10mm以上 ）は、その大きな負荷容量のため、使用可能な量の物質を精製するために使用される。
分析用カラム（4.6 mm）は最も一般的なカラムの種類ですが、より細いカラムの人気が急速に高まっています。[ 50 ]これらはサンプルの従来の定量分析に使用され、多くの場合、 UV-Vis吸光度検出器が使用されます。
細径カラム（1～2 mm）は、特殊なUV-Vis検出器、蛍光検出器、または液体クロマトグラフィー質量分析法などの他の検出方法を 用いて、より高い感度が求められる用途に使用されます。
キャピラリーカラム（0.3 mm未満）は、質量分析法 などの代替検出方法とほぼ exclusively 併用されます。これらは通常、より大型のカラムで使用されるステンレス鋼管ではなく、溶融シリカ製のキャピラリーで作られています。
従来のHPLCのほとんどは、小さな球状のシリカ粒子（非常に小さなビーズ）の外側に固定相を付けて行われます。これらの粒子はさまざまなサイズがあり、5 μmのビーズが最も一般的です。一般的に、粒子が小さいほど表面積が大きくなり、分離が良くなりますが、最適な線速度に必要な圧力は粒子径の2乗の逆数で増加します。[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]
カラム速度、効率、背圧の式[ 54 ]によると、粒子径を半分に減らし、カラムのサイズを同じに保つと、カラム速度と効率は2倍になりますが、背圧は4倍になります。また、小さな粒子のHPLCは、幅の広がりを減らすこともできます。[ 55 ]より大きな粒子は、分取HPLC（カラム径5cmから30cm以上）や、固相抽出などの非HPLCアプリケーションで使用されます。
多くの固定相は、表面積を増やすために多孔質構造になっています。細孔が小さいほど表面積は大きくなりますが、細孔が大きいほど反応速度が速く、特に大きな分析対象物に対しては有利です。例えば、細孔よりわずかに小さいだけのタンパク質は細孔に入り込むことはできますが、一度入ると容易には出られません。
ポンプの圧力容量は様々ですが、その性能は、一貫性があり再現性のある体積流量を生み出す能力によって測定されます。圧力は最大で 60 MPa (6000 lbf/in 2 )、つまり約 600気圧に達することがあります。最新の HPLC システムは、はるかに高い圧力で動作するように改良されており、そのため、カラム内ではるかに小さな粒子サイズ (<2 μm) を使用できます。これらの「超高性能液体クロマトグラフィー」システム、または UHPLC は、超高圧クロマトグラフィー システムとも呼ばれ、最大120 MPa (17,405 lbf/in 2 )、つまり約 1200気圧で動作できます。[ 57 ] 「UPLC」 [ 58 ]という用語はWaters Corporationの商標ですが、UHPLC のより一般的な技術を指すために使用されることもあります。
HPLC検出器は、汎用型と選択型の2つの主要なカテゴリに分類されます。汎用型検出器は通常、移動相と溶質を含む移動相との間の物理的特性の差を測定することによって、バルク特性（屈折率など）を測定しますが、選択型検出器は、溶質の物理的または化学的特性に反応することによって、溶質の特性（ UV-Vis吸光度など）を測定します。[ 59 ] HPLCでは、最も一般的にはUV-Vis吸光度検出器が使用されますが、他のさまざまなクロマトグラフィー検出器も使用できます。UV-Vis吸光度検出を補完する汎用型検出器は、荷電エアロゾル検出器（CAD）です。一般的に使用される検出器の一種には、フローセルを通過する溶出液の屈折率の変化を測定することによって読み取り値を提供する屈折率検出器があります。特定のケースでは、複数の検出器を使用することが可能です。たとえば、LCMSは通常、UV-Visと質量分析計を組み合わせて使用します。
HPLC-ECDは、電気化学検出器（ECD）と併用することで、神経化学分析研究用途において、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質を選択的に検出します。 [ 60 ] HPLC-ECDは、フェムトモル濃度範囲の神経伝達物質を検出します。神経伝達物質を検出する他の方法としては、液体クロマトグラフィー質量分析法、ELISA、ラジオイムノアッセイなどがあります。
HPLCオートサンプラーを使用することで、多数のサンプルをHPLCシステムに自動的に注入できます。さらに、HPLCオートサンプラーは、各注入で注入量と注入方法がまったく同じであるため、注入量の精度が非常に高くなります。サンプリングチャンバー内でサンプルを攪拌することも可能で、均一性を高めることができます。[ 61 ]
HPLCは、実験室科学と臨床科学の両方で多くの用途があります。医薬品開発では、製品の純度を確実に得る方法であるため、一般的に使用されている技術です。[ 62 ] HPLCは非常に高品質（純粋）の製品を製造できますが、バルク医薬品の製造で常に主要な方法として使用されるわけではありません。[ 63 ]欧州薬局方によると、HPLCは合成のわずか15.5%で使用されています。[ 64 ]しかし、米国薬局方では合成の44%で使用されています。[ 65 ]これは、大規模なHPLCは高価な技術であるため、金銭的および時間的制約の違いによる可能性があります。HPLCで得られる特異性、精度、正確性の向上は、残念ながらコストの増加に対応します。
この技術は、さまざまなサンプル中の違法薬物の検出にも使用されます。[ 66 ]薬物検出の最も一般的な方法は、免疫測定法です。[ 67 ]この方法ははるかに便利です。しかし、便利さは特異性と広範囲の薬物のカバー率を犠牲にするため、代替方法としてHPLCも使用されています。HPLCは純度を決定（および場合によっては向上）する方法であるため、薬物の濃度を評価する際にHPLCのみを使用すると、やや不十分でした。したがって、この文脈では、HPLCは質量分析法と組み合わせて実行されることがよくあります。[ 68 ]ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）の代わりに液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を使用すると、面倒な追加ステップとなる可能性のあるアセチル化剤またはアルキル化剤による誘導体化の必要性を回避できます。[ 69 ] LC-MSは、ドーピング剤、薬物代謝物、グルクロン酸抱合体、アンフェタミン、オピオイド、コカイン、BZD、ケタミン、LSD、大麻、農薬など、さまざまな物質の検出に使用されています。[ 70 ] [ 71 ]質量分析法と併用してHPLCを実行すると、HPLC実験実行の標準化の必要性が絶対的に減少します。
同様のアッセイは、抗真菌薬や喘息薬などの臨床候補物質の濃度を検出する研究目的で実施できます。[ 72 ]この技術は、採取したサンプル中の複数の種を観察するのにも明らかに有用ですが、種の同定に関する情報を求める場合は標準溶液の使用が必要です。この種の研究では純度が不可欠であるため、合成反応の結果を確認する方法として使用されます。ただし、質量分析法は依然として種の同定においてより信頼性の高い方法です。
HPLCの医療用途では、通常、検出器として質量分析計（MS）を使用するため、この技術はLC-MS [ 73 ]またはタンデムMSの場合はLC-MS/MSと呼ばれ、2種類のMSが順次動作します。[ 74 ] HPLC装置が複数の検出器に接続されている場合、ハイフン付きLCシステムと呼ばれます。医薬品用途[ 75 ]は、HPLC、LC-MS、およびLC-MS/MSの主要なユーザーです。[ 76 ]これには、医薬品開発[ 77 ]および薬理学（薬物や化学物質が生物に及ぼす影響の科学的研究）[ 78 ] 、個別化医療[ 79 ] 、公衆衛生[ 80 ] [ 81 ]および診断[ 82 ]が含まれます。薬物濃度を分析するための最も一般的な媒体は尿ですが、HPLCを用いたほとんどの医療分析では、血清がサンプルとして採取されます。[ 83 ]臨床検査室における LC-MS および LC-MS/MS の最も重要な役割の 1 つは、代謝障害の新生児スクリーニング (NBS) [ 84 ]およびその後の診断です。[ 85 ] [ 86 ]乳児のサンプルは乾燥血液スポット (DBS) の形をしており、[ 87 ]準備と輸送が簡単なため、地域的にも世界的にも安全でアクセスしやすい診断が可能になります。
臨床研究に有用な分子検出の他の方法、すなわち免疫測定法がHPLCと比較試験されている。その一例として、競合タンパク質結合アッセイ（CPBA）とHPLCがビタミンDの検出感度について比較された。小児のビタミンD欠乏症の診断に有用なこのCPBAの感度と特異度は、HPLCの能力のそれぞれ40%と60%にしか達しないことがわかった。[ 88 ]高価なツールではあるが、HPLCの精度はほぼ比類のないものである。
{{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2026年1月現在非アクティブです（リンク）