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SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、Ulrich K. Laemmliによって開発された不連続電気泳動システムであり、分子量が 5 ～ 250 kDaのタンパク質を分離する方法として一般的に使用されています。[ 1 ] [ 2 ]ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、別名ラウリル硫酸ナトリウム）とポリアクリルアミドゲルを併用することで、構造と電荷の影響が排除され、タンパク質はサイズの違いによって分離されます。少なくとも 2025 年までは、この方法を記述した論文は、単一の著者による最も頻繁に引用された論文であり、全体では 2 番目に多く引用された論文で、引用数は 259,000 回を超えています。[ 2 ] [ 3 ]
SDS-PAGEは、質量によるタンパク質の分離を可能にする電気泳動法です。媒体（「マトリックス」とも呼ばれる）は、ポリアクリルアミドをベースとした不連続ゲルです。ポリアクリルアミドゲルは通常、スラブゲルの2枚のガラス板の間に挟まれています。チューブゲル（ガラスシリンダー内）は歴史的に使用されていましたが、より便利なスラブゲルの発明により急速に廃れました。[ 4 ]さらに、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）が使用されます。約1.4グラムのSDSが1グラムのタンパク質に結合し、[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] 2つのアミノ酸あたり1つのSDS分子の電荷に相当します。[ 8 ] SDSは界面活性剤として働き、タンパク質の固有の電荷を覆い隠し、非常に類似した電荷対質量比を与えます。タンパク質の固有電荷はSDS負荷量に比べてごくわずかであり、分離ゲルの塩基性pH範囲では正電荷も大幅に減少します。一定の電場を印加すると、タンパク質は質量に応じて異なる速度で陽極に向かって移動します。この簡便な手順により、質量によるタンパク質の精密な分離が可能になります。
SDSは、臨界ミセル濃度（CMC）と呼ばれる特定の濃度を超えると、水溶液中で球状ミセルを形成する傾向があります。溶液中のSDSは、臨界ミセル濃度7～10ミリモルを超えると、単量体（モノマー）とミセルの両方として同時に存在し、CMC未満では、水溶液中ではモノマーとしてのみ存在します。臨界ミセル濃度では、ミセルは約62個のSDS分子から構成されます。[ 9 ]ただし、SDSモノマーのみが疎水性相互作用を介してタンパク質に結合し、SDSミセルは外側が陰イオン性で、タンパク質を吸着しません。[ 5 ] SDSは両親媒性であるため、タンパク質構造の極性部分と非極性部分の両方をほどくことができます。[ 10 ] SDS濃度が0.1ミリモルを超えると、タンパク質のほどけが始まり、[ 5 ] 1 mMを超えると、ほとんどのタンパク質が変性します。[ 5 ] SDSの強い変性作用とそれに続くタンパク質複合体の解離のため、一般的にSDSでは四次構造を決定することはできません。例外は、共有結合架橋（例えば-SS-結合）によって安定化されたタンパク質と、SDS存在下でも安定なSDS耐性タンパク質複合体です（ただし、後者は室温でのみ）。SDS耐性複合体を変性させるには、加熱によって達成される高い活性化エネルギーが必要です。SDS耐性は、タンパク質フォールドの準安定性に基づいています。天然の完全に折り畳まれたSDS耐性タンパク質はSDS存在下では十分な安定性を持ちませんが、室温での変性の化学平衡はゆっくりと進行します。安定なタンパク質複合体は、SDS耐性だけでなく、プロテアーゼに対する安定性と生物学的半減期の延長によっても特徴付けられます。[ 11 ]
あるいは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、カチオン界面活性剤CTABを用いたCTAB-PAGE [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]、または16-BACを用いたBAC-PAGE [ 15 ]でも行うことができる。
SDS-PAGE法は、ゲル調製、試料調製、電気泳動、タンパク質染色またはウェスタンブロッティング、および生成されたバンドパターンの分析から構成される。
ゲルに異なるバッファーを使用する場合（不連続ゲル電気泳動）、拡散によってバッファーが混ざらないように、ゲルは電気泳動の1日前までに作製されます。ゲルは、 2枚の密閉されたガラス板と、その間にスペーサーを挟んだ型の中で、フリーラジカル重合によって作製されます。典型的なミニゲル設定では、スペーサーの厚さは0.75 mmまたは1.5 mmで、これがゲルのロード容量を決定します。ゲル溶液を注ぐために、通常、ガラス板はスタンドに固定され、2枚のスペーサーでガラス板の開いている下面を一時的に密閉します。ゲル溶液には、ゲル形成剤としてアクリルアミド（通常、スタッキングゲルでは4% V/V、 分離ゲルでは10～12%）、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド、スタッキングゲルまたは分離ゲルバッファー、水、およびSDSが混合されます。触媒TEMEDとラジカル開始剤過硫酸アンモニウム（APS）を加えることで、重合が開始されます。[ 16 ]次に、気泡が発生しないようにガラス板の間に溶液を注ぎます。触媒とラジカル開始剤の量と温度に応じて、重合は15分から数時間続きます。下側のゲル（分離ゲル）を最初に注ぎ、水にほとんど溶けないアルコール（通常は緩衝液で飽和したブタノールまたはイソプロパノール）を数滴かけて覆います。これにより、メニスカスから気泡が除去され、ゲル溶液がラジカル捕捉剤の酸素から保護されます。分離ゲルの重合後、アルコールは廃棄され、残留アルコールはろ紙で除去されます。スタッキングゲル溶液にAPSとTEMEDを加えた後、固体分離ゲルの上に注ぎます。その後、気泡が発生しないように適切なサンプルコームをガラス板の間に挿入します。重合後、サンプルコームを慎重に引き抜くと、サンプル塗布用のポケットが残ります。タンパク質配列決定のために後で使用する場合、ゲルは電気泳動の前日に準備されることが多く、これは未重合のアクリルアミドとタンパク質中のシステインとの反応を低減するためである。
グラジエントミキサーを使用すると、アクリルアミドのグラジエント（通常4～12%）を持つグラジエントゲルを鋳造でき、分子量の分離範囲が広くなります。[ 17 ]市販のゲルシステム（いわゆるプレキャストゲル）では、通常、スタッキングゲルと分離ゲルの両方で、pH値が6.4～7.2のビス-トリスメタン緩衝物質を使用します。 [ 18 ] [ 19 ]これらのゲルは鋳造済みで、すぐに使用できます。1つの緩衝液（連続ゲル電気泳動）のみを使用し、pHがほぼ中性であるため、数週間保存できます。pHが中性に近づくと、加水分解が遅くなり、ポリアクリルアミドの分解が遅くなります。さらに、タンパク質中のアクリルアミド修飾システインが少なくなります。[ 18 ]収集ゲルと分離ゲルのpHが一定であるため、スタッキング効果はありません。 BisTrisゲル中のタンパク質はルテニウム錯体で染色できません。[ 20 ]このゲルシステムは比較的広い分離範囲を持ち、泳動バッファーにMESまたはMOPSを使用することでその範囲を変えることができます。 [ 18 ]
サンプル調製中、サンプルバッファー、したがってSDSがタンパク質に過剰に添加され、サンプルは95 ℃で5分間、または70 ℃で10分間加熱されます。加熱により、水素結合が切断され、分子が引き伸ばされることで、タンパク質の二次構造と三次構造が破壊されます。必要に応じて、ジスルフィド結合は還元によって切断できます。この目的のために、β-メルカプトエタノール（ β-ME、5体積%）、ジチオスレイトール（DTT、10～100ミリモル）[ 21 ] 、ジチオエリスリトール（DTE、10ミリモル）、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン[ 22 ]またはトリブチルホスフィン[ 21 ]などの還元性チオールがサンプルバッファーに添加されます。室温まで冷却した後、各サンプルをピペットでゲル内のそれぞれのウェルに注入する。ゲルはあらかじめ電気泳動装置内で電気泳動バッファーに浸しておいたものである。
サンプルに加えて、通常は分子量サイズマーカーがゲルにロードされます。これは既知のサイズのタンパク質で構成されており、ゲルの異なるトラックで平行に移動する実際のサンプル中のタンパク質のサイズを（±10%の誤差で）推定することができます。[ 23 ]サイズマーカーは、ゲルの最初または最後のポケットにピペットで注入されることがよくあります。
分離のために、変性させたサンプルをポリアクリルアミドゲルにロードし、適切な電解質を含む電気泳動バッファーに浸します。その後、電圧（通常は約100V、ゲル長1cmあたり10～20V）を印加すると、負に帯電した分子がゲル内を正に帯電した陽極の方向に移動します。ゲルはふるいのように機能します。小さなタンパク質はゲルの網目を比較的容易に通過しますが、大きなタンパク質はゲル内に留まりやすく、ゲル内をゆっくりと移動するため、分子サイズによってタンパク質を分離することができます。電気泳動は、使用する電圧とゲルの長さに応じて、30分から数時間かかります。
最も速く移動するタンパク質（分子量5 kDa未満）は、電気泳動バッファーの陰イオン成分とともにバッファーフロントを形成し、これらの成分もゲル内を移動します。バッファーフロント領域は、比較的分子量の小さい陰イオン色素であるブロモフェノールブルーをサンプルバッファーに添加することで可視化されます。ブロモフェノールブルーは分子サイズが比較的小さいため、タンパク質よりも速く移動します。移動する着色バンドを光学的に制御することで、色素とサンプルがゲル内を完全に移動してゲルから出る前に電気泳動を停止することができます。
最も一般的に使用される方法は、不連続SDS-PAGEです。[ 24 ] [ 25 ]この方法では、タンパク質はまず中性pHの収集ゲルに移動し、そこで濃縮され、次に塩基性pHの分離ゲルに移動し、そこで実際の分離が行われます。スタッキングゲルと分離ゲルは、異なる細孔サイズ（4～6 %Tと10～20 %T）、イオン強度、およびpH値（pH 6.8またはpH 8.8）で異なります。最も頻繁に使用される電解質は、SDSを含むトリス-グリシン-塩化物緩衝系です。中性pHでは、グリシンは主に両性イオン型を形成し、高pHではグリシンは正電荷を失い、主に陰イオンになります。収集ゲルでは、より小さく負に帯電した塩化物イオンがタンパク質の前方に移動し（先行イオンとして）、やや大きく負に帯電し部分的に正に帯電したグリシン酸イオンがタンパク質の後方に移動します（初期後続イオンとして）。一方、比較的塩基性の分離ゲルでは、両方のイオンがタンパク質の前方に移動します。スタッキングゲルと分離ゲルの緩衝液間のpH勾配により、スタッキングゲルと分離ゲルの境界でスタッキング効果が生じます。これは、pHの上昇に伴いグリシン酸イオンが減速する正電荷を部分的に失い、その後、以前の後続イオンとしてタンパク質を追い越して先行イオンとなり、染色後に見える異なるタンパク質のバンドがより狭くシャープになるためです。これがスタッキング効果です。より小さなタンパク質やペプチドの分離には、0.5～50 kDaの範囲でタンパク質の広がりが大きいため、Schäggerとvon JagowのTRIS-トリシン緩衝液システムが使用されます。[ 26 ]
電気泳動分離の最後に、すべてのタンパク質はサイズごとに分類され、その後、他の方法、例えば、クーマシー染色（最も一般的で使いやすい）[ 27 ] [ 28 ] 、銀染色（最も感度が高い）[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] 、すべての染色、アミドブラック10B染色[28]、ファストグリーンFCF染色[ 28 ] 、エピココノン染色[ 35 ]やSYPROオレンジ染色[36]などの蛍光染色、およびウェスタンブロットなどの免疫学的検出[ 37 ] [ 38 ]によって分析することができます。蛍光色素は、タンパク質の量と色の強度の間に比較的高い直線性があり、検出限界（色の強度によって推定できるタンパク質の量）より約3桁高い値を示します。蛍光タンパク質染色剤トリクロロエタノールを使用する場合、ゲル溶液に添加し、電気泳動後にゲルに紫外線を照射すれば、その後のタンパク質染色は省略される。[ 39 ] [ 40 ]
クマシー染色では、ゲルを50%エタノールと10%氷酢酸の溶液に1時間浸漬して固定します。その後、溶液を新しい溶液に交換し、1～12時間後にゲルを染色液（50%メタノール、10%氷酢酸、0.1%クマシーブリリアントブルー）に交換し、続いて40%メタノールと10%氷酢酸の脱色液を数回交換して脱色します。
ゲル内でのタンパク質染色により、様々なタンパク質の記録可能なバンドパターンが形成される。
バンドパターンの記録は通常、写真撮影またはスキャンによって行われる。個々のバンド内の分子を回収するために、ゲル抽出を行うことができる。
タンパク質染色とバンドパターンの記録の後、ポリアクリルアミドゲルは保存用に乾燥させることができます。[ 43 ]後日、そこからタンパク質を抽出できます。ゲルは乾燥フレーム（加熱の有無にかかわらず）または真空乾燥機に入れられます。乾燥フレームは2つの部分から構成され、そのうちの1つは湿ったセロハンフィルムのベースとして機能し、そこにゲルと1%グリセロール溶液が加えられます。次に、2番目の湿ったセロハンフィルムを気泡が入らないように貼り付け、2番目のフレーム部分を上に置き、クリップでフレームを密封します。気泡を取り除くことで、乾燥中にゲルが断片化するのを防ぎます。水はセロハンフィルムを通して蒸発します。乾燥フレームとは対照的に、真空乾燥機は真空を作り出し、ゲルを約50 ℃に加熱します。
分子量をより正確に決定するために、分離ゲル中の個々のタンパク質バンドの相対移動距離を測定します。[ 44 ] [ 45 ]測定は通常、精度を高めるために3回繰り返して行います。相対移動度（Rf値またはRm値と呼ばれる）は、タンパク質バンドの移動距離をバッファーフロントの移動距離で割った値として定義されます。距離はそれぞれ分離ゲルの開始点から測定されます。バッファーフロントの移動は、サンプルバッファーに含まれる色素の移動にほぼ対応します。サイズマーカーのRf値は、既知の分子量に対して半対数的にプロットされます。生成されたグラフの線形部分との比較、または回帰分析によって、未知のタンパク質の分子量をその相対移動度から決定できます。[ 44 ] [ 46 ]
グリコシル化タンパク質のバンドはぼやけることがある[ 41 ]。グリコシル化はしばしば不均一であるためである[ 47 ] 。塩基性アミノ酸を多く含むタンパク質（例えばヒストン）[ 48 ]は、正電荷のために電気泳動での移動速度が遅くなったり、逆方向に移動したりするため、分子量の過大評価につながるか、ゲルに全く移動しないことがある。一方、酸性アミノ酸を多く含むタンパク質は、移動速度が速くなり、分子量の過小評価につながる可能性がある[ 49 ] 。
SDS-PAGEとタンパク質染色法を組み合わせた方法は、生化学においてタンパク質の迅速かつ正確な分離とそれに続く分析に広く用いられています。装置と試薬のコストが比較的低く、使いやすい方法です。しかし、スケールアップが難しいため、主に分析目的で使用され、特に多量のタンパク質を分離するような調製目的での使用は少ないのが現状です。
さらに、SDS-PAGEは、タンパク質の混合物中の特定のタンパク質の存在を判定するため、または翻訳後修飾を分析するために、ウェスタンブロットと組み合わせて使用されます。[ 50 ] [ 51 ]タンパク質の翻訳後修飾は、異なる相対移動度（つまりバンドシフト）またはウェスタンブロットで使用される検出抗体の結合の変化（つまりバンドの消失または出現）につながる可能性があります。
タンパク質の質量分析において、SDS-PAGEは質量分析前の試料調製法として広く用いられており、主にゲル内消化法が用いられます。タンパク質の分子量を決定するという点では、SDS-PAGEは分析超遠心分離よりも精度が高いものの、質量分析や（翻訳後修飾を無視した場合の） DNA配列からの分子量計算よりも精度は劣ります。
医療診断において、SDS-PAGEはHIV検査の一部として、またタンパク尿の評価に用いられます。HIV検査では、HIVタンパク質がSDS-PAGEによって分離され、その後、患者の血清中にHIV特異的抗体が存在する場合は、ウェスタンブロット法によって検出されます。タンパク尿検査におけるSDS-PAGEは、尿中の様々な血清タンパク質（例えば、アルブミン、α2-マクログロブリン、IgGなど）のレベルを評価します。
SDS-PAGEは、タンパク質のゲル電気泳動分離に最も広く用いられている方法です。二次元ゲル電気泳動は、等電点電気泳動またはBAC-PAGEとSDS-PAGEを順次組み合わせたものです。 [ 52 ] [ 53 ]ネイティブPAGEは、天然タンパク質の折り畳みを維持する場合に用いられます。膜タンパク質の分離には、SDS-PAGEの代替としてBAC-PAGEまたはCTAB-PAGEを用いることができます。より大きなタンパク質複合体の電気泳動分離には、アガロースゲル電気泳動（例： SDD-AGE ）を用いることができます。一部の酵素は、ザイモグラフィーによる酵素活性によって検出できます。[ 54 ]
SDS-PAGEは、より精密で低コストなタンパク質分離および分析方法の1つですが、タンパク質を変性させます。非変性条件が必要な場合は、ネイティブPAGEまたはさまざまなクロマトグラフィー法によってタンパク質を分離し、その後光度測定による定量を行います。たとえば、アフィニティークロマトグラフィー（またはタンデムアフィニティー精製）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどです。[ 55 ]タンパク質は、接線流ろ過[ 56 ]または限外ろ過[ 57 ]によってサイズ別に分離することもできます。混合物から単一のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーまたはプルダウンアッセイによって分離できます。歴史的に初期の費用対効果の高い粗雑な分離方法には、通常、コスモトロピック分子を使用した一連の抽出と沈殿に基づくものがあり、たとえば、硫酸アンモニウム沈殿とポリエチレングリコール沈殿などがあります。
1948年、アルネ・ティセリウスは、電気場における荷電した溶解原子または分子の移動としての電気泳動の原理の発見により、ノーベル化学賞を受賞しました。 [ 58 ]ゾーン電気泳動で固体マトリックス（最初は紙ディスク）を使用することで分離が改善されました。1964年にL.オルンスタインとBJデイビスによって行われた不連続電気泳動により、スタッキング効果により分離が改善されました。[ 59 ]以前使用されていた紙ディスクやデンプンゲルとは対照的に、架橋ポリアクリルアミドヒドロゲルを使用することで、ゲルの安定性が向上し、微生物による分解がなくなりました。連続ポリアクリルアミドゲルにおけるSDSの変性効果とそれに伴う分解能の向上は、1965年にジェームズ・E・ダーネルの研究グループでデビッド・F・サマーズによってポリオウイルス蛋白質の分離のために初めて記述されました。[ 60 ]現在のSDS-PAGEの変種は、1970年にウルリッヒ・K・レムリによって記述され、当初はバクテリオファージT4の頭部のタンパク質を特徴づけるために使用されました。[ 1 ]
{{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2025年7月現在非アクティブです（リンク）