菌根菌

化石と遺伝学的証拠は、菌根が4億5000万～5億年前に出現し、おそらく菌類のような原生生物と藻類の間で起こったことを示している。アーバスキュラー菌根関係が最も早く現れ、植物の陸上化と同時期であった。^{[ 17 ]}遺伝学的証拠は、すべての陸上植物が単一の共通祖先を共有していることを示しており、^{[ 18 ]}その祖先は菌根共生を急速に採用したようで、原始菌根菌が植物の陸上化を可能にした重要な要因であったことを研究が示唆している。^{[ 19 ]}古菌学者の間では、菌根菌が初期の陸上植物の原始的な根系として機能したという強いコンセンサスがある。^{[ 17 ]}これは、植物が陸上に定着する前は、土壌は栄養分が少なく、植物はまだ根系を発達させていなかったためである。複雑な根系がなければ、初期の陸上植物は、植物の成長に不可欠な栄養素であるリン酸塩などの鉱物基質から難分解性イオンを吸収することができなかっただろう。^{[ 20 ]}

グロムス菌類の胞子と菌糸の化石は4億6000万年前のものとされていますが、これらの化石は植物とは関連していませんでした。初期の陸上生物群集は現代の生物地殻に似ていました。菌類とシアノバクテリアの地衣類のような共生関係は、これらの群集の重要な部分でした。最初の陸上植物は、単純な維管束系を持ち、葉や根を持たないコケ類に似ていました。^{[ 21 ]}

初期の菌根共生の最も古い直接的な化石証拠は、4億700万年前のライニーチャートに見られ、そこには複数のパラ菌根菌にコロニー形成された「非常に保存状態の良い」化石植物群が含まれている。^{[ 10 ]}ライニーチャートの化石は、グロムス菌類とムコール菌類が、アグラオフィトン・マヨールとホルネオフィトン・リグニエリという植物の細胞と菌根様の共生関係にあることを示している。化石は、植物とコロニー形成された菌類との間に相利共生関係があったことを示唆している。なぜなら、特徴的な栄養交換構造（グロムス菌類ではアーバスキュル、ムコール菌類では菌糸コイル）が保存されており、コロニー形成された細胞は菌類に感染した時点で生きていたように見えるからである。^{[ 21 ]}

これらの初期の共生関係は、菌根が植物の根への菌類の定着によって定義され、初期の植物には根がなかったため、菌根様または準菌根と呼ばれます。植物の根におけるアーバスキュラー菌根菌の最古の化石は3億1500万～3億300万年前のもので、巨大なヒカゲノカズラ類であるLepidodendronと針葉樹の初期の近縁種であるCordaitesの根系にGlomeromycotinaに属する菌類が見られます。^{[ 21 ]}アーバスキュラー菌根菌は、2億4000万年前のAntarcticycas schopfiiの化石で発見されました。

外生菌根はジュラ紀にかなり遅れて発達したが、ランやツツジの菌根を含む他のほとんどの現代的な菌根共生形態は、白亜紀の被子植物の放散期に遡る。^{[ 22 ]}外生菌根は、4870万年前の始新世に、マツの根にコロニーを形成した外生菌根菌の化石として化石記録に現れる。^{[ 23 ]}しかし、最初の外生菌根関係は、中期ジュラ紀の約1億7500万年前のマツ科冠群の放散の頃に、マツ科幹群で進化したと考えられている。^{[ 23 ]}

エリカ菌根菌とラン菌根菌の化石保存は不十分である。較正された分子系統学は、これらの菌根菌の起源を推定するために使用される。^{[ 23 ]}ラン菌根菌の起源は不明であるが、ラン自体は白亜紀に起源したと考えられている。エリカ菌根菌は、菌根菌の中で最も新しい進化起源を持ち、約1億1800万年前に自由生活性の腐生祖先から進化したと推定されている。^{[ 24 ]}エリカ菌根菌は、主にレオチオミケス綱の子嚢菌類とセレンディピタ科の担子菌類など、複数の菌類の系統から進化した。^{[ 25 ]}

植物では、菌根共生を形成する遺伝子は高度に保存されており、共通の祖先から由来しているため、菌根を形成する能力はすべての陸上植物の祖先である。^{[ 26 ]}アブラナ科などの非菌根植物系統は、進化の過程で菌根を形成する能力を失った。^{[ 27 ]}最も初期の菌根はアーバスキュラー菌根であり、外生菌根やラン菌根などの他の形態は、植物宿主がグロムス菌類との共生から異なる菌類系統との共生に切り替わったときに進化した。^{[ 28 ]}

マメ科植物と窒素固定細菌の共生関係は菌根共生に由来するという遺伝学的証拠がある。 ^{[ 29 ]}菌根菌の現代における分布は、新生代における被子植物の優勢に伴う根の形態の複雑化と競争の増大を反映しているようで、種間の複雑な生態学的動態が特徴である。^{[ 30 ]}

菌類において、菌根共生は菌類の様々な系統間で複数の独立した起源を持つ。アーバスキュラー菌根菌は独自の単系統群を形成する一方、他の菌根菌は収斂進化によって類似した生活様式を獲得した。

植物と菌類の共生には菌根菌に似た形態もあるが、別個のものと考えられている。その一例が菌類内生菌である。内生菌は、植物に害を与えることなく植物細胞内に生息できる生物と定義される。内生菌は、植物外部から栄養素を取り込むための栄養輸送構造を持たない点で菌根菌と区別される。^{[ 38 ]}菌根菌の系統の中には、内生菌から菌根菌へと進化したものもあると考えられており、^{[ 41 ]}一部の菌類は菌根菌としても内生菌としても生息できる。

外生菌根は、植物細胞に侵入せず、代わりに細胞間に侵入するハーティグ網と呼ばれる構造を形成するという点で独特である。 ^{[ 42 ]}外生菌根は、根の先端を覆う菌糸鞘（マントル）と、根皮質内の植物細胞を取り囲む菌糸のハーティグ網から構成される。場合によっては菌糸が植物細胞に侵入することもあり、その場合は菌根は内生菌根と呼ばれる。根の外側では、外生菌根の菌糸体は土壌や落葉層内に広範なネットワークを形成する。アーバスキュラー菌根、エリカ菌根、アルブトイド菌根、モノトロポイド菌根、ラン菌根などの他の形態の菌根は内生菌根とみなされる。^{[ 43 ]}

外生菌根（EcM）は、植物科の約10％の根と、カバノキ科、フタバガキ科、ユーカリ科、オーク科、マツ科、バラ科[44]などの木本植物、ラン科[45]、担子菌類、子嚢菌類、接合菌類に属する菌類との間の共生関係です。外生菌根は、地球^上の植物種の^{約2 ％}という比較的少数の植物種と共生していますが、共生している種は、その生態系で非常に優勢な樹木や木本植物がほとんどです。つまり、外生菌根関係にある植物は、植物バイオマスの大部分を占めています。^{[ 46 ]} LeccinumやSuillusなど一部の EcM 菌類は、特定の 1 つの属の植物とのみ共生しますが、Amanitaなどの他の菌類は、多くの異なる植物と菌根を形成します。^{[ 47 ]} 1 つの樹木は、一度に 15 種以上の異なる菌類 EcM パートナーを持つことがあります。^{[ 48 ]} EcM に関与する植物の多様性は低いですが、EcM に関与する菌類の多様性は高いです。数千種の外生菌根菌が存在し、200 属以上に属しています。最近の研究では、世界の外生菌根菌種の豊富さを控えめに約 7750 種と推定していますが、大型菌類の多様性の既知と未知の推定に基づくと、ECM 種の豊富さの最終的な推定値はおそらく 20,000 ～ 25,000 種の間になるでしょう。^{[ 49 ]}外生菌根菌は、そのグループの歴史の中で腐生菌の祖先から何度も独立して進化してきた。^{[ 50 ]}

菌類ネットワークを介して、異なる植物間で栄養素が移動することが示されています。炭素は、シラカバの苗から隣接するダグラスファーの苗に移動することが示されていますが、共通の菌根ネットワークを介しているとは断定されていません。 ^{[ 51 ]}これにより、生態系の遷移が促進されます。^{[ 52 ]}外生菌根菌Laccaria bicolorは、窒素を得るためにトビムシを誘引して殺すことがわかっています。その一部は、菌根宿主植物に転送される可能性があります。KlironomosとHartの研究では、L. bicolorを接種したイースタンホワイトパインは、窒素の最大25%をトビムシから得ることができました。^{[ 53 ] [ 54 ]}非菌根の細根と比較すると、外生菌根には、有毒金属（カドミウム、銀）や塩素などの微量元素が非常に高濃度で含まれている可能性があります。^{[ 55 ]}

共生菌の代表である外生菌根担子菌L. bicolorの最初のゲノム配列は2008年に発表された。^{[ 56 ]}この菌類ではいくつかのマルチジーンファミリーが拡大しており、共生への適応は遺伝子重複によって進行したことを示唆している。系統特異的遺伝子の中で、共生制御分泌タンパク質をコードする遺伝子は外生菌根の根端で発現が上昇しており、パートナー間のコミュニケーションにおける役割を示唆している。L . bicolorは植物細胞壁成分（セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ペクチン酸塩）の分解に関与する酵素を欠いており、共生体が根のコロニー形成中に宿主細胞を分解することを防いでいる。対照的に、L. bicolorは細菌および微小動物の多糖類およびタンパク質の加水分解に関連する拡大したマルチジーンファミリーを持っている。このゲノム解析により、菌根菌が土壌と生きた植物の根の両方で生育できる腐生性と生物栄養性の二重の生活様式を持つことが明らかになった。それ以来、他の多くの外生菌根菌種のゲノムが配列決定され、これらの生物の遺伝子ファミリーと進化の研究がさらに拡大している。 ^{[ 57 ]}

アーバスキュラー菌根（以前は小胞状アーバスキュラー菌根と呼ばれていた）は、植物細胞に侵入する菌糸を持ち、植物細胞内に栄養交換のための枝分かれした樹木状の構造であるアーバスキュルを形成します。多くの場合、小胞と呼ばれる風船状の貯蔵構造も形成されます。この相互作用において、菌糸は実際には原形質（つまり細胞の内部）に侵入するのではなく、細胞膜を陥入して、いわゆる周アーバスキュラー膜を形成します。アーバスキュルの構造は、菌糸と宿主細胞の細胞質との接触表面積を大幅に増加させ、両者間の栄養移動を促進します。アーバスキュラー菌根は絶対的生物栄養性であり、成長と繁殖の両方において宿主植物に依存しています。つまり、枯死した植物物質を分解して自らを維持する能力を失っています。^{[ 60 ]}植物宿主によって作られた光合成産物の 20 パーセントが菌類によって消費され、陸上宿主植物からの炭素の移動は、菌類から植物宿主への同量のリン酸と交換される。^{[ 61 ]}

外生菌根に見られるパターンとは対照的に、AMFの種多様性は非常に低いが、植物宿主の多様性は非常に高い。推定では、全植物種の78%がAMFと共生している。^{[ 46 ]}アーバスキュラー菌根は、グロムス門 の菌類によってのみ形成される。化石の証拠^{[ 10 ]}とDNA配列解析^{[ 62 ]}は、この共生関係が最初の植物が陸地に進出した4億〜4億6千万年前に出現したことを示唆している。アーバスキュラー菌根は全植物科の85%に見られ、多くの作物種にも見られる。^{[ 44 ]}地球の表層土壌には、地球から太陽までの距離の約 10 億倍に相当する、約 110 京キロメートル^{[ 63 ]}のアーバスキュラー菌根菌の菌糸が存在し、そのバイオマスは約 300 メガトンの炭素、つまり全人類のバイオマスの約 4 ～ 6 倍であると推定されている。アーバスキュラー菌根菌の菌糸は、土壌中の炭素の主要な貯蔵庫の 1 つである可能性のある糖タンパク質グロマリンを生成する。アーバスキュラー菌根菌の菌糸は、土壌中の炭素の主要な貯蔵庫の 1 つである可能性のある糖タンパク質グロマリンを生成する。^{[ 64 ]}アーバスキュラー菌根菌は（おそらく）何百万年も無性生殖を行っており、珍しいことに、個体は遺伝的に異なる多数の核を含むことができる（異核症と呼ばれる現象）。^{[ 65 ]}

ムコール菌類に属する菌根菌は「細根内生菌」（MFRE）として知られていますが、最近までアーバスキュラー菌根菌と誤って同定されていました。MFREはAMFに似ていますが、グロムス菌類ではなくムコール菌類亜門に属します。植物の根に定着する際の形態はAMFと非常によく似ていますが、MFREは細かい菌糸を形成します。^{[ 42 ]} MFREの効果は、AMFとMFREがしばしば同じ宿主に同時に定着するという事実によって、両者の混同により、誤ってAMFに起因するものとされた可能性があります。AMFとは異なり、MFREは宿主なしで生存できるようです。この菌根菌のグループについてはほとんど理解されていませんが、湿潤で酸性の土壌を好み、ゼニゴケ類、ツノゴケ類、ヒカゲノカズラ類、被子植物と共生関係を形成するようです。^{[ 66 ]}

エリカ菌根（ErM）は、ツツジ目の植物のみに関与し、主要な菌根関係の中で最も新しく進化したものです。エリカ菌根を形成する植物は、主に木質の低木で、宿主としてはブルーベリー、ビルベリー、クランベリー、マウンテンローレル、シャクナゲ、ヒース、ネイネイ、ジャイアントグラスツリーなどがあります。ErMは北方林で最も一般的ですが、地球上の森林の3分の2で見られます。^{[ 46 ]}エリカ菌根菌は、菌類のいくつかの異なる系統に属しています。一部の種は、ツツジ目以外の植物であっても、植物細胞内に完全に内生菌として生息したり、腐生菌として独立して死んだ有機物を分解したりすることができます。このように複数の生活様式を切り替えることができるため、エリカ菌根菌は非常に適応性が高いと言えます。^{[ 38 ]}

これらの共生に参加する植物は、根毛のない特殊な根を持ち、菌類が侵入して完全に占拠する表皮細胞の層で覆われています。^{[ 42 ]}菌類は、根の最外層の細胞に密な菌糸のコイルからなる単純な根内（細胞内での成長）段階を持ちます。根周段階はなく、根外段階は、周囲の土壌にあまり深く伸びないまばらな菌糸から構成されています。菌類は子実体（おそらく小さなカップの形）を形成する可能性がありますが、その生殖生物学はよく理解されていません。^{[ 40 ]}

エリカ菌根共生に関与する植物は、酸性で栄養分の乏しい環境に生息している。^{[ 38 ]} AMFは腐生能力を失っており、EcM菌は腐生生活に必要な酵素を生成する能力に大きなばらつきがあるのに対し、^{[ 46 ]} ErMに関与する菌類は、栄養源として植物物質を分解する能力を完全に保持している。エリカ菌根菌の中には、有機物を分解するための酵素のレパートリーを実際に拡大しているものもある。セルロース、ヘミセルロース、リグニン、ペクチン、キチンから窒素を抽出できる。これにより、共生する植物パートナーに提供できる利益が増加する。^{[ 68 ]}

すべてのランは、ライフサイクルのある段階で菌従属栄養性であり、ラン菌根を形成しなければ生存できないことを意味します。ランの種子は非常に小さいため、発芽した実生を維持するための栄養分を含まず、代わりに菌類共生体から成長に必要なエネルギーを得なければなりません。^{[ 42 ]} OM の関係は非対称であり、植物は菌類よりも多くの利益を得ているようで、一部のランは完全に菌従属栄養性であり、光合成のための葉緑素を欠いています。菌類から炭素の一部を受け取らない完全な独立栄養性のランが存在するかどうかは実際には不明です。^{[ 69 ]} ErM を形成する菌類と同様に、OM 菌類は内生菌または独立した腐生菌として生存できる場合があります。OM 共生では、菌糸が根細胞に侵入し、栄養交換のためにペロトン (コイル) を形成します。

このタイプの菌根は、ツツジ科のモノトロポイデア亜科、およびラン科のいくつかの属に見られます。これらの植物は従属栄養性または混合栄養性であり、炭素を菌類パートナーから得ています。したがって、これは非相利共生型の寄生的な菌根共生です。

植物は、菌根菌や植物に定着する数千もの微生物など、他の生物と相利共生関係をうまく築くために、共生者と病原体を区別し、共生者が定着できるようにしながら、病原体に対して免疫応答を活性化する必要がある。植物のゲノムは、他の生物からの化学信号を検出するための潜在的に数百の受容体をコードしている。植物は、植物が検出したフィードバックに応じて共生生物との相互作用を変化させ、共生応答と免疫応答を動的に調整する。^{[ 73 ]}植物では、菌根共生は共通共生シグナル伝達経路（CSSP）によって制御されており、これは、マメ科植物の根粒菌などの内生共生菌や内生共生生物による定着の開始と維持に関与する一連の遺伝子である。 CSSPは植物による陸上への進出よりも前に起源を持ち、植物とアーバスキュラー菌根菌の共進化が5億年以上前に遡ることを示している。^{[ 50 ]}アーバスキュラー菌根菌では、根から分泌される植物ホルモンであるストリゴラクトンの存在が土壌中の菌胞子の発芽を誘発し、菌類の代謝、成長、分岐を刺激し、植物が感知できる化学信号を菌類が放出するように促す。^{[ 74 ]}植物と菌類が互いを適切な共生体として認識すると、植物は共通の共生シグナル伝達経路を活性化し、菌類が定着できるようにする根組織の変化を引き起こす。^{[ 75 ]}

アーバスキュラー菌根菌を用いた実験では、共生が始まる前に共生候補の間で起こる「化学的対話」に関与する多数の化学物質が特定されている。植物では、ほぼすべての植物ホルモンがAMF共生の開始または調節に役割を果たしており、他の化学物質もシグナル伝達機能を持つと考えられている。菌類から放出されるシグナルについてはあまり理解されていないが、Myc因子として知られるキチン質分子がアーバスキュラー菌根の形成に不可欠であることが示されている。植物からのシグナルは、LysM含有受容体様キナーゼ、またはLysM-RLKによって検出される。AMFゲノムは、潜在的に数百のエフェクタータンパク質をコードしており、そのうち菌根共生に効果があることが証明されているのはごくわずかだが、他の多くのタンパク質も植物宿主とのコミュニケーションに機能していると考えられる。^{[ 74 ]}

菌根共生の開始には多くの要因が関わっているが、特に影響力があるのは植物のリンの必要性である。リン欠乏を感知する能力を失わせる突然変異を持つイネを用いた実験では、植物がリン欠乏を感知すると、アーバスキュラー菌根菌の検出、定着、コロニー形成が促進されることが示されている。^{[ 66 ]}窒素欠乏もAMF共生の開始に役割を果たしている。^{[ 74 ]}

菌根菌が吸収を促進するメカニズムには、物理​​的なものと化学的なものがある。物理的には、ほとんどの菌根菌糸は最小の根や根毛よりも直径がはるかに小さいため、根や根毛が届かない土壌物質を探査することができ、吸収のための表面積を大きくすることができる。化学的には、菌類の細胞膜の化学は植物のそれとは異なる。例えば、菌類は多くのイオンを溶解またはキレートする有機酸を分泌したり、イオン交換によってミネラルからイオンを放出したりすることがある。^{[ 76 ]}菌根菌は、栄養分の乏しい土壌では特に植物パートナーにとって有益である。^{[ 77 ]}

菌根共生関係により、菌類はグルコースやスクロースなどの炭水化物に比較的安定して直接アクセスできる。^{[ 78 ]}炭水化物は、その供給源（通常は葉）から根組織を経て、植物の菌類パートナーへと転流される。その見返りとして、植物は菌糸体の水とミネラル栄養素に対する高い吸収能力の恩恵を受ける。これは、菌糸の表面積が大きく、植物の根毛よりもはるかに長く細いことと、一部の菌類が植物の根では利用できない土壌ミネラルを動員できることによるものである。その結果、植物のミネラル吸収能力が向上する。^{[ 79 ]}

補助のない植物の根は、化学的または物理的に固定された栄養素を吸収できない場合があります。例としては、リン酸イオンや鉄などの微量栄養素が挙げられます。このような固定化の一形態は、粘土含有量の多い土壌や、pHが強アルカリ性の土壌で発生します。しかし、菌根菌の菌糸は、このような栄養源の多くにアクセスし、コロニーを形成する植物に利用できるようにします。^{[ 80 ]}そのため、多くの植物は、土壌を供給源として使用せずにリン酸を得ることができます。固定化のもう1つの形態は、栄養素が木材などの分解の遅い有機物に固定されている場合で、一部の菌根菌は直接分解生物として機能し、栄養素を移動させて一部を宿主植物に渡します。たとえば、一部の栄養不足の森林では、大量のリン酸やその他の栄養素が、落葉に直接作用する菌根菌の菌糸によって吸収され、土壌からの吸収の必要性が回避されます。^{[ 81 ]}焼き畑による熱帯雨林破壊の代替として提案されたアグロフォレストリー技術であるインガアレイクロッピングは、^{[ 82 ]}インガ属の植物の根系内の菌根菌を利用して、雨が土壌からリンを洗い流すのを防いでいる。 ^{[ 83 ]}

より複雑な関係では、菌根菌は固定された土壌栄養素を集めるだけでなく、地下の菌糸ネットワークを通して水、炭素、その他の栄養素を植物から植物へ直接輸送する菌根ネットワークによって個々の植物同士を結びつけます。^{[ 84 ]}

担子菌類であるSuillus tomentosus は、宿主植物であるロッジポールパイン( Pinus contorta var. latifolia ) と共に、結節状外生菌根と呼ばれる特殊な構造を形成します。これらの構造には窒素固定細菌が生息しており、窒素を大量に供給し、マツが栄養分の乏しい場所に定着することを可能にしています。 ^{[ 85 ]}

菌根植物は、土壌微生物病原体によって引き起こされる病気などに対して、より抵抗力があることが多い。これらの共生関係は、地上と地下の両方で植物の防御に役立つことがわかっている。菌根は、線虫などの土壌生物に毒性のある酵素を分泌することがわかっている。^{[ 86 ]}最近の研究では、菌根共生は、基本的に一次免疫応答として機能する植物のプライミング効果をもたらすことが示されている。この共生関係が形成されると、植物が攻撃を受けているときに起こる応答と同様に、防御応答が活性化される。この接種の結果、菌根共生を持つ植物では防御応答がより強くなる。^{[ 87 ]}菌根菌によって提供される生態系サービスは、土壌微生物叢に依存する可能性がある。^{[ 88 ]}さらに、菌根菌は土壌の物理的変数と有意に相関しているが、水分レベルのみで、団粒安定性とは相関していない^{[ 89 ] [ 90 ]}また、干ばつの影響に対する耐性を高めることもできる。^{[ 91 ] [ 92 ] [ 93 ]}さらに、菌根菌の重要性には、塩ストレスの緩和と植物の成長と生産性に対する有益な効果も含まれる。塩分は菌根菌に悪影響を与える可能性があるが、多くの報告では、塩ストレス条件下で菌根植物の成長とパフォーマンスが向上していることが示されている。^{[ 94 ]}

菌根菌によって菌根ネットワークでつながれた植物は、これらの地下のつながりを利用して警告信号を伝達することができます。^{[ 95 ] [ 96 ]}例えば、宿主植物がアブラムシに攻撃されると、その植物は周囲のつながった植物に自分の状態を知らせます。宿主植物とそれにつながった植物の両方が、アブラムシを忌避し、アブラムシの捕食者である寄生バチを引き寄せる揮発性有機化合物を放出します。^{[ 95 ]}これは、菌根菌の食料供給を節約することで、菌根菌を助けます。^{[ 95 ]}

滅菌土壌や培地で栽培された植物は、菌根菌の胞子や菌糸を添加して植物の根に定着させ、土壌中のミネラル栄養素の吸収を助けないと、生育が悪くなることが多い。 ^{[ 97 ]}菌根菌がないと、初期遷移段階や劣化した景観での植物の成長も遅くなることがある。^{[ 98 ]}栄養不足の生態系に外来の菌根植物を導入すると、在来の非菌根植物は競争上不利になる。^{[ 99 ]}不毛な土壌に定着するこの能力は、貧栄養植物というカテゴリーで定義される。

菌類は、酸性土壌や汚染土壌など、金属濃度が高い土壌に根を張る植物に対して保護的な役割を果たします。汚染されたいくつかの場所に植えられた、Pisolithus tinctoriusを接種したマツの木は、蔓延している汚染物質に対する高い耐性、生存率、成長を示しました。 ^{[ 100 ]}ある研究では、亜鉛に対する耐性が異なるSuillus luteus株の存在が発見されました。別の研究では、亜鉛耐性Suillus bovinus株がPinus sylvestrisの植物に耐性を付与することが発見されました。これはおそらく、有益な物質の交換に影響を与えることなく、金属が菌類の菌糸体外に結合するためでしょう。^{[ 99 ]}