誘導多能性幹細胞

誘導多能性幹細胞は、2006年に京都大学の山中伸弥氏と高橋和俊氏によって初めて作製されました。 ^{[ 1 ]}彼らは、胚性幹細胞（ESC）の機能に重要な遺伝子が成体細胞に胚性状態を誘導できるのではないかと仮説を立てました。彼らは、以前にESCで重要であると特定された24個の遺伝子を選択し、レトロウイルスを使用してこれらの遺伝子をマウス線維芽細胞に導入しました。線維芽細胞は、ESC特異的遺伝子Fbx15を再活性化する細胞を抗生物質選択によって分離できるように遺伝子操作されました。

24種類の因子すべてを投与すると、Fbx15レポーターを再活性化し、無限に増殖できるES細胞様コロニーが出現した。リプログラミングに必要な遺伝子を特定するため、研究者らは24種類の因子の中から1つずつ因子を除去していった。この過程を経て、Oct4、Sox2、cMyc、Klf4の4つの因子が特定された。これらの因子はそれぞれ必要であり、かつ組み合わせることで、Fbx15の再活性化を選択的に促すES細胞様コロニーを生成するのに十分であることが分かった。

2007年6月、山中氏の研究グループ、ハーバード大学とカリフォルニア大学ロサンゼルス校の共同研究グループ、そしてMITの研究グループを含む3つの研究グループが、リプログラミング手法を大幅に改善し、ES細胞と区別がつかないiPS細胞を作製した研究を発表した。第一世代のiPS細胞とは異なり、これらの第二世代のiPS細胞は生存可能なキメラマウスを作製し、マウスの生殖細胞系列に貢献することで、多能性幹細胞の「ゴールドスタンダード」を達成した。

これらの第2世代iPSCは、同じ4つの転写因子（Oct4、Sox2、cMyc、Klf4）のレトロウイルスを介した発現によってマウス線維芽細胞から誘導されました。しかし、研究者らは多能性細胞を選択するためにFbx15を使用する代わりに、 ESCで機能的に重要な遺伝子であるNanogを使用しました。この異なる戦略を使用することで、研究者らはESCと機能的に同一のiPSCを作成しました。^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

誘導多能性細胞の生成は、誘導に用いられる転写因子に大きく依存する。

Oct-3/4とSox遺伝子ファミリーの特定の産物（Sox1、Sox2、Sox3、Sox15）は、誘導プロセスに関与する重要な転写調節因子として同定されており、これらが欠如すると誘導は不可能になる。しかし、Klfファミリーの特定のメンバー（Klf1、Klf2、Klf4、Klf5）、Mycファミリー（c-myc、L-myc、N-myc）、Nanog、LIN28などの追加の遺伝子は、誘導効率を高めることが確認されている。^{[ 27 ]}

• Oct-3/4 (Pou5f1) Oct-3/4 は、オクタマー ("Oct") 転写因子ファミリーの 1 つであり、多能性の維持に重要な役割を果たしています。割球や胚性幹細胞などの^{Oct-3/4 +}細胞で Oct-3/4 が欠如すると、自発的な栄養膜分化が起こり、Oct-3/4 が存在すると、胚性幹細胞の多能性と分化能が発現します。Oct-3/4 の近縁遺伝子である Oct1やOct6を含む、"Oct" ファミリーの他のさまざまな遺伝子は誘導を誘発しないため、誘導プロセスには Oct-3/4 が特異であることが示されています。Schöler は、リプログラミング中に Oct4 を過剰発現させると、エピジェネティックな変化が起こり、iPSC の品質が低下することを示しました。 OSKM（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）と比較して、新しいSKM（Sox2、Klf4、c-Myc）リプログラミングは、四倍体胚補完によって全iPSCマウスを生成する能力によって決定されるように、胚性幹細胞と同等の発生能を持つiPSCを生成します。 ^{[ 28 ] [ 29 ]}キメラSox因子を使用してOct4とSox2の二量体化を強化することによって、より高い発生能を持つiPSCを生成することもできます。 ^{[ 30 ]}
• Soxファミリー：Soxファミリーの転写因子は、Oct-3/4と同様に多能性の維持に関与しているが、多能性幹細胞と単能性幹細胞の両方に関与しており、多能性幹細胞でのみ発現するOct-3/4とは対照的である。Sox2は、山中ら、Jaenischら、Thomsonらによって誘導に最初に使用された遺伝子であったが、Soxファミリーの他の転写因子も誘導プロセスで同様に機能することがわかっている。Sox1はSox2と同様の効率でiPSCを生成し、 Sox3、 Sox15、 Sox18遺伝子も効率は低下するもののiPSCを生成する。Velychkoらは、マウス、ヒト、カニクイザル、ブタ、ウシのiPSCの生成を促進または可能にするキメラ型スーパーリプログラミング因子Sox2-17または「スーパーSox」を設計した。 ^{[ 30 ]}
• Klfファミリー：転写因子KlfファミリーのKlf4は、山中らによって最初に同定され、JaenischらによってマウスiPS細胞の生成因子として確認され、山中らによってヒトiPS細胞の生成因子としても実証されました。しかし、Thomsonらは、Klf4はヒトiPS細胞の生成には不要であり、実際にはヒトiPS細胞の生成に失敗したと報告しました。Klf2とKlf4はiPS細胞を生成できる因子であることが判明し、関連遺伝子であるKlf1とKlf5も、効率は低いものの同様にiPS細胞を生成できることがわかりました。
• Mycファミリー：Mycファミリーの転写因子は、癌に関与するプロトオンコジーンです。YamanakaらとJaenischらは、c-mycがマウスiPS細胞の生成に関与する因子であることを示し、Yamanakaらは、それがヒトiPS細胞の生成に関与する因子であることを示しました。しかし、Thomsonら、Yamanakaらは、iPS細胞の誘導に「myc」ファミリー遺伝子を使用することは、iPS細胞を臨床治療として使用する可能性にとって問題であり、c-myc誘導iPS細胞を移植したマウスの25%が致死性奇形腫を発症しました。N -mycとL-mycは、c-mycの代わりに同様の効率で誘導することが確認されています。
• Nanog：胚性幹細胞において、NanogはOct-3/4およびSox2とともに多能性を促進するために必要である。そのため、ThomsonらがNanogを因子の一つとしてiPS細胞を作製できると報告しているにもかかわらず、山中らがNanogは誘導に不要であると報告したことは驚きであった。
• LIN28：LIN28はmRNA結合タンパク質^{[ 31 ]}であり、胚性幹細胞および胚性癌細胞で発現し、分化および増殖に関与している。Thomsonらは、 LIN28がOct4、Sox2、およびNanogと組み合わさってiPSC生成の因子である^{ことを実証した[ 18 ] 。}
• Glis1：Glis1は、Oct-3/4、Sox2、Klf4とともに多能性を誘導するために使用できる転写因子です。C-mycの代わりに使用した場合、多くの利点があります。 ^{[ 32 ]}

山中氏らが開拓した手法によって、成体細胞をiPS細胞にリプログラミングできることが実証されたものの、この技術には依然として課題が残っている。

1. 効率が低い: 一般的に、iPS細胞への変換は非常に低い。たとえば、山中らの最初のマウス研究では、体細胞がiPS細胞に再プログラムされた割合は0.01～0.1%であった。 ^{[ 1 ]}この低い効率率は、再プログラム遺伝子の正確なタイミング、バランス、および絶対的な発現レベルの必要性を反映している可能性がある。また、元の体細胞集団または長期培養におけるまれな遺伝的またはエピジェネティックな変化の必要性を示唆している可能性もある。しかし、最近、ヌクレオソームリモデリングおよび脱アセチル化（NuRD）複合体のダウンレギュレーションを必要とする効率的な再プログラム化の道が発見された。NuRDのサブユニットであるMbd3の過剰発現は、iPSCの誘導を阻害する。一方、Mbd3の枯渇は再プログラム化効率を向上させ、^{[ 33 ]}マウスおよびヒト細胞から7日以内にほぼ100%の効率で決定論的かつ同期的なiPS細胞の再プログラム化をもたらす。^{[ 34 ]}
2. ゲノム挿入: 転写因子のゲノムへの組み込みは、標的細胞のゲノムに突然変異が挿入されるリスクがあるため、転写因子アプローチの有用性を制限します。^{[ 35 ]}ゲノム挿入を回避するための一般的な戦略は、入力に別のベクターを使用することです。プラスミド、アデノウイルス、トランスポゾンベクターはすべて検討されていますが、これらは多くの場合、スループットの低下というトレードオフを伴います。^{[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]}
3. 腫瘍形成性：使用する方法によっては、iPSCを得るために成体細胞を再プログラム化する過程で重大なリスクが生じ、ヒトへの使用が制限される可能性がある。例えば、ウイルスを用いて細胞のゲノムを改変すると、癌遺伝子（癌を引き起こす遺伝子）の発現が誘発される可能性がある。2008年2月、科学者らは、多能性誘導後に癌遺伝子を除去できる技術を発見したと発表し、ヒト疾患におけるiPS細胞の使用可能性を高めた。^{[ 39 ]}別の研究では、山中らは、癌遺伝子c-MycなしでiPSCを作成できることを報告した。このプロセスは時間がかかり、効率も劣ったが、得られたキメラは癌を発症しなかった。^{[ 40 ]}癌の主要な制御因子である腫瘍抑制因子p53の不活性化または欠失は、再プログラム化効率を大幅に向上させる。^{[ 41 ]}したがって、再プログラム化効率と腫瘍発生の間にはトレードオフがあるように思われる。
4. 不完全なリプログラミング：リプログラミングは完全性という課題にも直面する。これは、細胞を完全にリプログラミングするためには、ゲノム全体のエピジェネティックコードを標的細胞型のものに再フォーマットする必要があるため、特に困難である。しかし、3つの異なるグループが、四倍体胚盤胞に注入できるマウス胚線維芽細胞（MEF）由来のiPS細胞を見つけ、iPS細胞のみから派生したマウスの生児出産に成功し、多能性に関して胚性幹細胞（ESC）とiPS細胞の同等性に関する議論に終止符を打った。^{[ 42 ]}

右側の表は、山中らによる2006年の画期的な発見以降、最初の5年間にiPS細胞の開発に用いられた主要な戦略と技術をまとめたものです。同じ色の行は、同様のリプログラミング戦略を用いた研究を表しています。

ヒトiPS細胞の魅力的な特徴は、成人患者からiPS細胞を作製してヒト疾患の細胞基盤を研究できることである。iPS細胞は自己複製能と多能性を持つため、理論的には体内のあらゆる種類の細胞に分化できる患者由来細胞の無限の供給源となる。これは、患者由来の他の多くの種類のヒト細胞は、実験室培養で数回継代すると増殖が停止する傾向があるため、特に重要である。iPS細胞は、ダウン症候群や多発性嚢胞腎などの一般的な疾患を含む、さまざまなヒト遺伝性疾患のために作製されている。^{[ 69 ] [ 70 ] [ 71 ]}多くの場合、患者由来のiPS細胞は、健常者のiPS細胞では観察されない細胞欠陥を示し、疾患の病態生理に関する洞察を提供する。^{[ 72 ] [ 73 ]}さまざまな疾患の薬剤スクリーニングのためのiPS細胞株のコレクションを構築するために、2012年に国際共同プロジェクトStemBANCCが設立された。オックスフォード大学が管理するこの取り組みは、10の製薬会社と23の大学から資金とリソースをプールした。目標は、模擬ヒト疾患環境を提供することで、初期の薬剤試験に使用される1,500のiPS細胞株のライブラリを作成することである。^{[ 74 ]}さらに、hiPSC技術と低分子または遺伝子コード化電圧およびカルシウムインジケーターを組み合わせることで、心血管薬剤の安全性スクリーニングのための大規模かつハイスループットなプラットフォームが提供される。^{[ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ]}

日本の研究者らは、人工多能性幹細胞（iPSC）を用いて移植用のヒト臓器を生成する概念実証に成功したと報告した。ヒト「肝芽」（iPSC-LB）は、3種類の異なる幹細胞（ iPSCから誘導した肝細胞（肝機能）、臍帯血由来の内皮幹細胞（血管内皮を形成）、間葉系幹細胞（結合組織を形成））を混合して培養された。この新しい手法では、胎児の発育過程を模倣し、異なる種類の細胞が自己組織化して複雑な臓器を形成する。数日間体外で培養した後、肝芽をマウスに移植したところ、「肝臓」は宿主の血管と速やかに結合し、成長を続けた。最も重要なのは、薬物代謝や肝臓特異的タンパク質の産生など、通常の肝臓機能を果たしたことである。今後の研究では、移植された臓器が宿主の体内でどれくらい長く生存するか（統合または拒絶を回避する能力）や、腫瘍に変化するかどうかを監視します。^{[ 80 ] [ 81 ]}

2021年には、腫瘍形成を伴わない損傷した心臓の再生のための切り替え可能な山中因子リプログラミングに基づくアプローチがマウスで実証され、介入が心臓発作の直前または直後に行われた場合に成功した。^{[ 82 ]} 2020年には、日本が初めて実験室で培養した心臓細胞をヒト患者に移植した。^{[ 83 ]}

胚性臍帯血細胞は、プラスミドDNAを用いて多能性幹細胞に誘導された。細胞表面の内皮細胞/周皮細胞マーカーCD31およびCD146を用いて、研究者らは「血管前駆細胞」、すなわち高品質の多能性血管幹細胞を同定した。iPS細胞をマウスの損傷した網膜の硝子体に直接注入すると、幹細胞は網膜に生着し、成長して血管を修復した。^{[ 84 ] [ 85 ]}

標識されたiPSC由来の神経幹細胞を脳病変のある実験動物に注入すると、病変部に遊走し、運動機能の改善が観察された。^{[ 86 ]}

拍動する心筋細胞であるiPSC由来心筋細胞は、化学的に定義された分化プロトコルを使用して大量生産できます。^{[ 87 ] [ 88 ]}これらのプロトコルは通常、心臓の発達に必要な同じ発生シグナル伝達経路を調節します。^{[ 89 ]}これらのiPSC心筋細胞は、由来した患者と同じ遺伝的背景を示すため、遺伝性不整脈や心臓薬の反応を再現できます。^{[ 90 ] [ 91 ] [ 92 ] [ 93 ]}

2014年6月、タカラバイオは京都大学iPS細胞研究所のベンチャー企業であるiHeart Japanから技術移転を受け、アジアでiPS細胞を心筋細胞に分化させる技術と特許を独占的に使用することが可能になった。同社は心筋細胞を製薬会社や大学に販売し、心臓病の新薬開発に役立てるという構想を発表した。^{[ 94 ]}

2018年3月9日、大阪大学の特定再生医療委員会は、iPS細胞から作製した「心筋シート」を重症心不全患者の心臓に移植する世界初の臨床研究計画を正式に承認した。大阪大学は同日、厚生労働省に申請書を提出したことを発表した。

2018年5月16日、臨床研究計画は厚生労働省の専門家グループにより条件付きで承認された。^{[ 95 ] [ 96 ]}

2019年10月、岡山大学の研究グループは、iPS細胞から分化させた心筋細胞を用いて虚血性心疾患のモデルを開発した。^{[ 97 ]}

献血された血液1パイントには約2兆個の赤血球が含まれており、世界中で1億700万回以上の献血が行われているにもかかわらず、輸血用の血液は依然として不足している。2014年、スコットランド国立輸血サービスでiPSCからO型赤血球が合成された。細胞は中胚葉、次に血液細胞、そして赤血球へと誘導された。最終段階は、核を排出させ、適切に成熟させることだった。O型はすべての患者に輸血できる。ヒト臨床試験は2016年以前には開始されないと予想されていた。^{[ 98 ]}

自家iPSCを用いた最初のヒト臨床試験は厚生労働省によって承認され、2014年に神戸の理化学研究所発生生物学総合研究センターで実施される予定だった。しかし、2015年11月に日本の新しい再生医療法が施行された後、試験は中断された。^{[ 99 ]}より具体的には、既存のガイドラインが強化され、法律の効力を持つようになった（以前は単なる勧告だった）。^{[ 100 ]}滲出型加齢黄斑変性症の患者6人の皮膚細胞から得られたiPSCが、網膜色素上皮（RPE）細胞に分化するように再プログラムされた。細胞シートは、変性したRPE組織が切除された患部の網膜に移植される予定だった。安全性と視力回復のモニタリングは1～3年間続く予定だった。^{[ 101 ] [ 102 ]}

2017年3月、高橋正代氏率いるチームは、進行性黄斑変性症患者の眼にドナー由来のiPS細胞から得られた網膜細胞を移植することに初めて成功した。^{[ 103 ]}しかし、現在合併症が発生していると報告されている。^{[ 104 ]}自家iPS細胞を使用する利点は、理論的には拒絶反応のリスクがなく、胚性幹細胞を使用する必要がないことである。しかし、これらのiPS細胞は他人から採取されたものである。^{[ 102 ]}

iPSCを用いた新たな臨床試験は、日本だけでなく米国やヨーロッパでも現在進行中である。^{[ 105 ]} 2021年の臨床試験登録サイトClinicaltrials.govの調査では、iPSCに言及している試験が129件確認されたが、そのほとんどは非介入型であった。^{[ 106 ]}

2026年、日本の薬事審議会は、パーキンソン病治療薬のアムケプリと重症心不全治療薬のリハートという2つの同種iPSCベースの治療薬について、厚生労働省に条件付き承認の延長を勧告した。 ^{[ 107 ]}

iPSCベースの再生医療技術をより多くの患者に提供するためには、HLAのハプロタイプに依存せずに移植できるユニバーサルiPSCを作成する必要がある。ユニバーサルiPSCを作成するための現在の戦略には、HLAの発現を除去することと、HLAの欠失によるNK細胞の攻撃を防ぐことという2つの主な目標がある。CRISPR /Cas9システムを使用してB2M遺伝子とCIITA遺伝子を欠失させると、それぞれHLAクラスIとクラスIIの発現が抑制されることが報告されている。NK細胞の攻撃を避けるために、 HLA-EやCD47などのNK細胞を阻害するリガンドの導入が用いられている。^{[ 108 ]} 12種類の一般的なHLA-Cアレルで世界人口の95%をカバーできるため、 HLA-Cは変更されない。^{[ 108 ]}

多能性間葉系幹細胞は、多能性に誘導されると、老化表現型を遅らせたり逆転させたりする可能性を秘めている。このような抗老化特性は、2017年の初期臨床試験で実証された。^{[ 109 ]} 2020年、スタンフォード大学の研究者らは、高齢マウスを研究した結果、高齢のヒト細胞が山中因子にさらされると若返り、若い細胞とほとんど区別がつかなくなる可能性があると結論付けた。^{[ 110 ]}

2025年に発表されたレビューでは、同種細胞療法における免疫拒絶のリスクを低減することを目的とした高度なゲノム編集技術を用いた低免疫原性多能性幹細胞（hPSC）の開発について検討している。これらのhPSCは、主要組織適合性複合体（MHC）クラスIおよびII分子の発現を欠くように設計されている一方で、PD-L1、CD47、HLA-Gなどの免疫調節遺伝子を発現する。この組み合わせにより免疫回避が強化され、ヒト白血球抗原（HLA）のマッチングを必要としない普遍的なドナー細胞の概念が支持される。誘導性カスパーゼ-9などの自殺遺伝子システムの統合により、悪性腫瘍が発生した場合に細胞を選択的に除去することが可能になり、安全性がさらに向上する。これらの戦略は、再生医療の安全性、拡張性、およびアクセス性を向上させることを目的としている。^{[ 111 ]}