胚様体

胚様体（EB ）は、多能性幹細胞によって形成される3次元の集合体です。これには、胚性幹細胞（ESC）と人工多能性幹細胞（iPSC）が含まれます。

EB は、ヒト胚性幹細胞が 3 つの胚葉からなる胚様体に分化したものです。初期胚に見られる特徴を模倣しています。EB は、発生生物学のさまざまな側面に関する研究を行うためのモデル システムとしてよく使用されます。また、組織工学や再生医療に焦点を当てた研究にも貢献できます。

胚様体を構成する多能性細胞の種類には、マウス（mESC）^{[1] [2]、} 霊長類^[3] 、 およびヒト（hESC）^[4]の胚の胚盤胞段階から得られる 胚性幹細胞（ESC）が含まれます。さらに、体細胞核移植^{[5] [6] [7]} 、または体細胞を再プログラムして誘導多能性幹細胞（iPS）を生成するなどの代替技術で得られた胚性幹細胞から胚様体を形成することもできます。^{[8] [9] [10] [11]}単層形式で培養された ESCと同様に、胚様体内のESCは、すべての体細胞タイプを構成する3つの生殖系列（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に沿って分化および細胞特異化します。^{[12] [13]}

しかし、単層培養とは対照的に、ESCが凝集して形成される球状構造により、EBを懸濁液中で非接着培養できるため、EB培養は本質的にスケーラブルであり、バイオプロセス手法に有用であり、これにより、潜在的な臨床応用に向けて大量の細胞を生産することができる。^{[14]さらに、EBは主に分化した細胞タイプの不均一なパターンを示すが、ESCは}胚発生を 指示する同様の合図に反応することができる。^[15]したがって、 EB微小環境内での複雑な細胞接着と傍分泌シグナル伝達 の確立を含む3次元構造により、 ^[16]分化と形態形成が可能になり、天然の組織構造に類似した微小組織が得られる。このような微小組織は、再生医療用途で損傷または病変組織を直接的に^[15]または間接的に^{[17] [18]}修復できるだけでなく、製薬業界でのin vitro試験や胚発生モデルとしても有望である。

EBは、未分化ES細胞に高度に発現しているCa2+依存性接着分子E-カドヘリンの同種親和性結合によって形成される。 ^{[19] [20] [21]} 抗分化因子の非存在下で単一細胞として培養すると、ES細胞は自発的に凝集してEBを形成する。^{[19] [22] [23] [24]このような自発的な形成は、培養基質ではなく単一細胞間の優先的な接着を促進するために、皿を}寒天や親水性ポリマーなどの非接着性材料でコーティングするバルク懸濁培養で達成されることが多い。hESCは単一細胞として培養するとアポトーシスを起こすため、EB形成には、低分子Y-27632 ^{[25]や2,4-二置換チアゾール（チアゾビビン/Tzv）などの}rho関連キナーゼ（ROCK）経路の阻害剤の使用が必要になることが多い。^[26] あるいは、単一細胞への解離を避けるために、ヒトES細胞から接着コロニー（またはコロニーの領域）を手動で分離し、その後懸濁液中で培養することによってEBを形成することもできる。懸濁液中でのEBの形成は大量のEBの形成に適しているが、結果として生じる凝集体のサイズを制御することはほとんどできず、しばしば大きく不規則な形のEBにつながる。代替として、ES細胞をバルク懸濁液中に接種すると、混合培養プラットフォームで付与される流体力によりEBサイズの均一性が高まる。^[27]

EB の形成は、ペトリ皿の蓋から吊り下げられた単一の液滴（10～20 μL）内に既知の細胞密度を接種することによっても、より正確に制御することができます。この方法はハンギングドロップとして知られています。^[21] この方法では、液滴あたりの細胞数を変更することで EB サイズを制御できますが、ハンギングドロップの形成は労働集約的であり、スケーラブルな培養には簡単には対応できません。さらに、従来のハンギングドロップ形式では培地を簡単に交換できないため、形成後 2～3 日後にハンギングドロップをバルク懸濁培養に移す必要があり、個々の EB が凝集する傾向があります。最近、改良されたハンギングドロップ形式で培地交換を可能にする新しい技術が開発されました。^[28] さらに、個々のウェル内で ESC を強制的に凝集させたり、接着性基質上に閉じ込めたりすることで細胞を物理的に分離する技術も開発されており、^{[29] [30] [31] [32]}これにより、スループットの向上と EB の制御された形成が可能になります。最終的には、EB形成に使用される方法は、凝集速度、EBのサイズと収量、および分化の軌跡の観点から、EB集団の異質性に影響を及ぼす可能性がある。^{[31] [33] [34]}

ESC分化プロトコルの文脈では、EB 形成は、3 つの生殖系列への自発的な分化を開始するための方法としてよく使用されます。EB 分化は、外部細胞を原始的な内胚葉表現型に指定することから始まります。^{[35] [36]} 次に、外側の細胞は、基底膜の組成と構造に似たコラーゲン IV とラミニンを含む細胞外マトリックス (ECM) を沈着させます。[ 37 ] [ 38 ] ECM^沈着に反応して、EB はしばしば嚢胞空洞を形成し、基底膜に接触している細胞は生存し続け、内部の細胞はアポトーシスを起こし、細胞に囲まれた液体で満たされた空洞が形成されます。^{[39] [40] [41]} その後の分化が進み、3 つの生殖系列の派生物が形成されます。サプリメントがない場合、ESC の「デフォルト」分化は主に外胚葉、続いて神経系統に向かっています。^{[42]しかし、}中胚葉と内胚葉の系統への分化を促進するために、牛胎児血清や特定の成長因子添加物 の使用を含む代替培地組成が開発されている。 ^{[43] [44] [45]}

EBの3次元構造の結果として、EB分化中に複雑な形態形成が起こり、上皮様および間葉様細胞集団の出現、ならびに上皮間葉転換（EMT）に関連するマーカーの出現が含まれる。^{[46] [47]} さらに、EB内の細胞集団間のシグナル伝達から生じる誘導効果は、空間的および時間的に定義された変化をもたらし、複雑な形態形成を促進する。^[48] EBをゼラチンなどの接着性基質上に播種すると、発生中の胚における初期の血管構造を思わせる血島の出現、ならびに神経突起伸展のパターン形成（ニューロン組織化を示す）および自発的な収縮活動（心筋細胞分化を示す）を含む組織様構造がEB内にしばしば示される。^[13] 最近では、EB分化の結果として、眼杯のような構造を含む複雑な構造が体外で作成された。^[49]

胚性幹細胞の分化と形態形成の中心となる研究の多くは、発生生物学と哺乳類の胚発生の研究に由来しています。^[15] たとえば、胚盤胞段階（ES細胞が由来する段階）の発生の直後に、胚は分化を起こし、それによって内部細胞塊の細胞仕様が下胚葉と上胚葉の形成をもたらします。^[50] 着床後発生の後の段階で、前後軸が形成され、胚は原始条片と呼ばれる一時的な構造を発達させます。^[51] 原始条片の形成と移動中に発生する空間パターンの多くは、 Wntおよび形質転換成長因子β （TGFβ）ファミリー（Lefty 1、Nodal）の成長因子、および同じ分子のリプレッサー（Dkk-1、Sfrp1、Sfrp5）を含むさまざまな細胞集団によるアゴニストとアンタゴニストの分泌によって生じます。 ^{[52] [53] [54]} 胚形成とES細胞の分化の類似性により、多くの同じ成長因子が誘導分化アプローチの中心となります。

さらに、EB培養の進歩により、対称性の破壊、局所的な短尾の発現、胚軸の形成（前後方向、背腹方向、左右方向）および胚葉形成のような動きなど、胚発生との顕著な類似点を示す胚オルガノイド（ガストルロイド）が開発されました。 ^{[46] [ 55] [ 56 ] [ 57 ] [58] [} 59 ] [46] [55] [56] [57]

可溶性モルフォゲンの添加と細胞外微小環境を正確かつ均一に制御できる単層培養におけるES細胞の分化とは対照的に、EBの3次元構造は指向性分化にとって課題をもたらします。^{[16] [60]} たとえば、EBの外側を形成する内臓内胚葉集団は、密に結合した上皮様細胞と高密度のECMからなる外部「シェル」を作成します。^{[61] [62]} このような物理的制限とEBのサイズが組み合わさって、 EB内で輸送制限が発生し、モルフォゲン、代謝物、栄養素の勾配が形成されます。^[60] 直径が約300μmを超える細胞凝集体では酸素輸送が制限されると推定されています。^[63]ただし、このような勾配の発生は分子サイズと細胞取り込み速度によっても影響を受けます。そのため、EBにモルフォゲンを送達すると、単層培養と比較して、分化細胞集団の不均一性が高まり、効率が低下します。EB内の輸送制限に対処する1つの方法は、EB構造内からのモルフォゲンのポリマー送達です。^{[61] [64] [65]}さらに、EBは個々の微小組織として培養し、その後、組織工学用途のためにより大きな構造に組み立てることができます。^[66] 3次元接着とシグナル伝達から生じる複雑さは、よりネイティブな組織構造を再現する可能性がありますが、^{[67] [68]}機械的、化学的、物理的シグナルが結果として生じる細胞表現型と形態形成に相対的にどのように寄与するかを理解するための課題も生み出します。

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