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生化学において、ヌクレアーゼ（古くはヌクレオデポリメラーゼまたはポリヌクレオチダーゼとも呼ばれる）は、ヌクレオチドを連結して核酸を形成するホスホジエステル結合を切断できる酵素である。ヌクレアーゼは、標的分子の一本鎖および二本鎖切断に様々な影響を与える。生物においては、ヌクレアーゼはDNA修復の多くの側面において不可欠な機構である。特定のヌクレアーゼの欠陥は、遺伝的不安定性または免疫不全を引き起こす可能性がある。[ 1 ]ヌクレアーゼは分子クローニングにも広く利用されている。[ 2 ]
活性部位に基づいて大きく2つの分類があります。エキソヌクレアーゼは核酸の末端から分解します。エンドヌクレアーゼは標的分子の中央領域に作用します。さらに、デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼに細分類されます。前者はDNAに作用し、後者はRNAに作用します。[ 2 ]
1960年代後半、科学者のスチュアート・リンとヴェルナー・アーバーは、大腸菌（E. coli）におけるファージ増殖抑制に関与する2種類の酵素の例を単離した。 [ 3 ] [ 4 ]これらの酵素のうち1つはDNAにメチル基を付加してメチル化DNAを生成し、もう1つは分子の長さに沿ってさまざまな場所で非メチル化DNAを切断した。最初のタイプの酵素は「メチラーゼ」、もう1つは「制限ヌクレアーゼ」と呼ばれた。これらの酵素ツールは、DNA分子を「切断して貼り付ける」ために必要なツールを集めていた科学者にとって重要だった。当時必要とされていたのは、分子の長さに沿ってランダムな場所ではなく、特定の場所でDNAを切断するツールであり、科学者が予測可能で再現性のある方法でDNA分子を切断できるようにすることだった。
1968年、ジョンズ・ホプキンス大学に勤務していたHO・スミス、KW・ウィルコックス、TJ・ケリーらが、特定のDNAヌクレオチド配列に依存する最初の制限酵素を単離・同定したことは、重要な進展であった。彼らはインフルエンザ菌を用いて、6塩基対の特定の配列内の特定の箇所で常にDNA分子を切断するHind IIと呼ばれる酵素を単離した。そして、 Hind II酵素は常にこの配列の中央（3番目と4番目の塩基対の間）を直接切断することを発見した。
ほとんどのヌクレアーゼは、国際生化学・分子生物学連合の「命名委員会」の酵素委員会番号（EC番号3）によって加水分解酵素に分類されます。ヌクレアーゼは、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼと同様に、加水分解酵素のサブグループであるエステラーゼ（EC番号3.1）に属します。ヌクレアーゼが属するエステラーゼは、EC番号3.1.11～3.1.31で分類されます。
ヌクレアーゼの一次構造は概して保存性が低く、活性部位では保存性が最小限であり、その表面は主に酸性および塩基性アミノ酸残基から構成されている。ヌクレアーゼは折りたたみファミリーに分類できる。[ 1 ]
ヌクレアーゼは核酸を切断する前に、まず核酸と結合する必要がある。そのためにはある程度の認識が必要となる。ヌクレアーゼは、認識と結合の様式において、非特異的結合と特異的結合の両方を様々に利用する。これらの両方の様式は、生物、特にDNA修復において重要な役割を果たしている。[ 1 ]
DNA修復に関与する非特異的エンドヌクレアーゼは、DNAをスキャンして標的配列または損傷を検出します。このようなヌクレアーゼは、標的に遭遇するまでDNAに沿って拡散し、標的に遭遇すると、その活性部位の残基がDNAの化学基と相互作用します。EcoRV 、BamHI 、PvuIIなどのエンドヌクレアーゼの場合、この非特異的結合は、タンパク質の最小表面積とDNAとの間の静電相互作用を伴います。この弱い結合により、DNAの全体的な形状は変形せず、B型のままになります。[ 1 ]
A部位特異的ヌクレアーゼは、対照的に、はるかに強い結合を形成します。DNAをDNA結合ドメインの深い溝に引き込みます。これにより、DNAの三次構造が大きく変形し、塩基性（正電荷）残基が豊富な表面によって実現されます。DNAと広範な静電相互作用を行います。 [ 1 ]
DNA修復に関与するヌクレアーゼの中には、部分的な配列特異性を示すものもある。しかし、ほとんどは非特異的であり、塩基対のミスマッチによってDNA骨格に生じた構造異常を認識する。 [ 1 ]
詳細については、フラップエンドヌクレアーゼを参照してください。
Hind IIが最初に発見されて以来、230 株以上の細菌から、配列特異的なものとそうでないものを含め、900 を超える制限酵素が単離されています。これらの制限酵素の名前は、一般的にその由来を反映しています。名前の最初の文字は属から、次の 2 文字は、それらが単離された原核細胞の種から来ています。たとえば、Eco RIはEscherichia coli RY13 細菌から、HindII はHaemophilus influenzae株 Rd から来ています。ヌクレアーゼ名の後に続く数字は、単一の細菌株から酵素が単離された順序を示しています。Eco RI、Eco RII。
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子の長さを「スキャン」することによって機能します。特定の認識配列に遭遇すると、DNA分子に結合し、2つの糖リン酸骨格のそれぞれに1つずつ切断します。これらの2つの切断の位置は、互いの位置関係と認識配列自体の位置関係の両方において、制限エンドヌクレアーゼの種類によって決まります。異なるエンドヌクレアーゼは異なる切断セットを生成しますが、1つのエンドヌクレアーゼは、作用するDNA分子の種類に関係なく、特定の塩基配列を常に同じように切断します。切断が行われると、DNA分子は断片に分解されます。[ 6 ]
すべての制限エンドヌクレアーゼが、上記で説明したHind IIのように対称的に切断して平滑末端を残すわけではありません。多くのエンドヌクレアーゼは、互いに直接反対側ではない位置でDNA骨格を切断し、オーバーハングを生成します。たとえば、ヌクレアーゼEco RIは、認識配列を持っています5'—GAATTC—3'。
酵素がこの配列に遭遇すると、Gと最も近いA塩基残基の間で各DNA骨格を切断します。切断が完了すると、生成された断片は、相補的な塩基同士を結びつける比較的弱い水素結合によってのみ結合されます。これらの結合が弱いため、DNA断片は互いに分離することができます。生成された各断片には、不対塩基からなる突出した5'末端があります。他の酵素はDNA骨格に切断を加え、突出した3'末端を生成します。突出した末端（3'末端と5'末端の両方）は、相補的な塩基配列と結合する傾向があるため、「粘着末端」と呼ばれることがあります。言い換えれば、不対塩基の配列が5'—AATT—3'別の不対塩基の配列に遭遇すると、3'—TTAA—5'それらは互いに結合します。つまり、互いに「粘着性」があるのです。次に、リガーゼ酵素を使用して、2つの分子のリン酸骨格を結合します。粘着末端の細胞由来、あるいは種由来は、その粘着性に影響を与えません。相補的な配列同士は、たとえ一方の配列がヒトDNA由来で、もう一方が細菌DNA由来であっても、結合する傾向がある。実際、この結合力こそが、異なる由来のDNAから構成される組換えDNA分子の生産を可能にし、遺伝子工学技術の誕生につながったのである。
すべての細胞が遺伝情報の媒体としてDNAに依存しているため、遺伝子品質管理はすべての生物にとって不可欠な機能です。DNA複製はエラーを起こしやすいプロセスであり、DNA分子自体も多くの代謝的および環境的ストレス要因によって変化を受けやすいです。普遍的な例としては、活性酸素種、近紫外線、電離放射線などがあります。多くのヌクレアーゼは、損傷部位を認識して周囲のDNAから切断することでDNA修復に関与しています。これらの酵素は独立して、または複合体として機能します。DNA修復に関与するヌクレアーゼのほとんどは配列特異的ではありません。それらは二本鎖DNA（dsDNA）の二次構造の変形によって損傷部位を認識します。[ 1 ]
DNA複製中、DNAポリメラーゼは 相補的な鋳型鎖に対して新しいDNA鎖を伸長します。ほとんどのDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼという2つの異なる酵素ドメインから構成されています。ポリメラーゼは新しい鎖を5'→3'方向に伸長します。エキソヌクレアーゼは、同じ鎖から3'→5'方向に誤ったヌクレオチドを除去します。このエキソヌクレアーゼ活性は、DNAポリメラーゼの校正能力に不可欠です。これらのヌクレアーゼを不活性化または除去する欠失は、影響を受けた微生物の突然変異率と死亡率、およびマウスの癌を増加させます。[ 1 ]
多くの種類のDNA損傷は複製フォークの進行を止め、DNAポリメラーゼと関連機構がフォークを放棄する原因となる。その後、フォーク特異的タンパク質によって処理されなければならない。最も注目すべきはMUS81である。MUS81の欠失は、減数分裂の欠陥に加えて、酵母におけるUVまたはメチル化損傷感受性を引き起こす。 [ 1 ]
細胞内で普遍的に行われている作業の一つに、複製から岡崎フラグメントRNAプライマーを除去することが挙げられる。このようなプライマーのほとんどは、 RNase Hファミリーのエンドヌクレアーゼによって、新たに合成されたラギング鎖DNAから切り出される。真核生物および古細菌では、フラップエンドヌクレアーゼFEN1も岡崎フラグメントの処理に関与している。[ 1 ]
あらゆる生物におけるDNAミスマッチ修復は、一連のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼによって行われる。原核生物では、この役割は主にMutSLHと超短鎖パッチ修復（VSP修復）関連タンパク質によって担われている。
MutSLHシステム（MutS、MutL、MutHから構成される）は、点突然変異と小さなターンを修復する。MutSはミスマッチを認識して結合し、そこでMutLとMutHをリクルートする。MutLはMutSとMutHの相互作用を媒介し、後者のエンドヌクレアーゼ活性を高める。MutHはヘミメチル化部位を認識し、非メチル化鎖（より最近合成された鎖）の5'—GATC—3'隣接部位を切断する。G
VSP修復はエンドヌクレアーゼVsrによって開始されます。Vsrは、メチル化シトシンがチミンにT/G自然に脱アミノ化されることで生じる特定のミスマッチを修復します。Vsrは配列を認識し、ミスマッチしたチミン（前の配列で下線が引かれている部分）の5'側でDNA鎖にニックを入れます。その後、エキソヌクレアーゼRecJ、ExoVII、またはExoIのいずれかがその部位を分解し、DNAポリメラーゼが鎖のギャップを再合成します。[ 1 ]5'—CTWGG—3'
AP部位の形成はdsDNAでよく見られる現象です。これは、塩基除去修復の中間段階として、自然加水分解とDNAグリコシラーゼの活性によって生じます。これらのAP部位は、 APエンドヌクレアーゼによって除去され、その部位周辺で一本鎖切断が起こります。[ 1 ]
ヌクレオチド除去修復（塩基除去修復と混同しないように注意が必要）は、損傷したヌクレオチドの除去と置換を伴う修復経路である。架橋、付加物、および（紫外線や活性酸素種によって生成される）損傷は、この修復経路を活性化する可能性がある。損傷したヌクレオチドを含む短い一本鎖DNA断片は、損傷部位の上流と下流でそれぞれ異なるエンドヌクレアーゼによって切断され、二本鎖DNAから除去される。これらのヌクレアーゼに影響を与える欠失や変異は、紫外線損傷に対する感受性の増加や発がんを引き起こす。このような異常は、神経発達にも影響を及ぼす可能性がある。
細菌では、両方の切断はUvrB-UvrC複合体によって実行されます。出芽酵母では、Rad2とRad1-Rad10複合体がそれぞれ5'と3'の切断を行います。哺乳類では、相同遺伝子XPGとXPF - ERCC1が同じ切断部位に影響を与えます。[ 1 ]
二本鎖切断は、意図的なものと意図的でないものの両方が細胞内で頻繁に発生する。意図的でない切断は、電離放射線、さまざまな外因性および内因性の化学物質、および停止した複製フォークによって一般的に発生する。意図的な切断は、減数分裂およびV(D)J組換えの中間体として発生し、主に相同組換えおよび非相同末端結合によって修復される。どちらの場合も、修復が行われる前に二本鎖切断の末端がヌクレアーゼによって処理される必要がある。そのようなヌクレアーゼの1つが、Rad50と複合体を形成したMre11である。Mre11の変異は、運動失調性毛細血管拡張症様疾患を引き起こす可能性がある。[ 1 ]
V(D)J組換えは、二本鎖切断に関連するステムループ構造を開き、その後両端を結合する反応である。Artemis -DNAPK cs複合体はこの反応に関与する。Artemisは単独では5'→3'一本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を示すが、 DNA-PK csと複合体を形成することで、ステムループのエンドヌクレアーゼ処理が可能になる。どちらかのタンパク質に欠陥があると、重度の免疫不全を引き起こす。[ 1 ]
一方、相同組換えは、Dループまたはホリデージャンクションで連結された2つの相同DNA二重らせんが関与する。細菌では、RuvCなどのエンドヌクレアーゼが、ジャンクション中心付近の2つの対称的な部位でジャンクションを切断することにより、ホリデージャンクションを2つの別々のdsDNAに分解する。真核生物では、 FEN1、XPF - ERCC1、およびMUS81がDループを切断し、Cce1 / Ydc2がミトコンドリアでホリデージャンクションを処理する。[ 1 ]
特定のヌクレアーゼが特定のDNA分子を切断する頻度は、DNAの複雑さとヌクレアーゼの認識配列の長さに依存します。特定の順序で塩基が偶然見つかる統計的確率により、認識配列が長いほど切断頻度は低くなります。たとえば、特定の4塩基配列（仮想ヌクレアーゼの認識部位に対応）は平均して256塩基対ごとに出現すると予測されます（4 4 =256）が、特定の6塩基配列は平均して4,096塩基対ごとに1回出現すると予想されます（4 6 =4096）。[ 7 ]
ヌクレアーゼの中でも特異なファミリーの一つにメガヌクレアーゼがあり、これは12～40塩基対からなる、より大きく、したがってあまり一般的ではない認識配列を持つことが特徴です。これらのヌクレアーゼは、植物や哺乳類などの複雑な生物における遺伝子工学やゲノム工学の応用において特に有用です。これらの生物では、通常、ゲノムが大きく（数十億塩基対）、従来のヌクレアーゼを用いると、部位特異的な切断が頻繁に起こり、有害な影響が生じるためです。