バイオコンジュゲーション

バイオコンジュゲーションは、少なくとも1つが生体分子である2つの分子の間に安定した共有結合を形成する化学戦略です。生体分子を結合させる方法は、医療、診断、生体触媒、材料など、さまざまな分野に応用されています。合成的に改変された生体分子は、細胞イベントの追跡、酵素機能の解明、タンパク質の生体内分布の決定、特定のバイオマーカーの画像化、標的細胞への薬物送達など、多様な機能を持つことができます。 ^{[1] [2] [3] [4]}

バイオコンジュゲーションは、これらの修飾された生体分子をさまざまな基質と結合させる重要な戦略です。バイオコンジュゲーションは、生物医学研究への応用に加えて、バイオコンジュゲーション量子ドットなどのナノテクノロジーでも最近重要性を増しています。

最も一般的なタイプのバイオコンジュゲーションは、小分子（ビオチンや蛍光色素など）をタンパク質に結合させることである。ブレンツキシマブ・ベドチンやゲムツズマブ・オゾガマイシンなどの抗体薬物複合体は、このカテゴリに該当する例である。^[5]バイオコンジュゲーションで使用されるその他のあまり一般的ではない分子には、オリゴ糖、核酸、ポリエチレングリコールなどの合成ポリマー、^[6]およびカーボンナノチューブがある。^[7]抗体と酵素の結合やタンパク質複合体の結合などのタンパク質間結合も、バイオコンジュゲーションによって促進される。^{[8] [9]}

バイオコンジュゲートの合成には、蛍光色素マーカーの単純で非特異的な使用から抗体薬物複合体の複雑な設計まで、さまざまな課題が伴います。^{[1] [3]}タンパク質を化学的に修飾するために、さまざまなバイオコンジュゲーション反応が開発されています。タンパク質に対する一般的なバイオコンジュゲーション反応には、リジン、システイン、チロシン アミノ酸残基のカップリング、およびトリプトファン残基とN末端とC末端の修飾があります。^{[1] [3] [4]}

しかし、これらの反応は、選択性を阻害する大量に存在する天然アミノ酸の存在に依存するため、化学選択性と効率性に欠けることが多い。合成分子をタンパク質の特定の部位に効果的に結合できる化学戦略の必要性が高まっている。1つの戦略は、最初にタンパク質に固有の官能基をインストールし、次に生体直交反応を使用して生体分子をこの固有の官能基と結合させることである。^[1]非天然官能基を標的とする生体直交反応は、バイオコンジュゲーション化学で広く使用されている。いくつかの重要な反応は、ケトンとアルデヒドの修飾、有機アジドとのシュタウディンガー連結、銅触媒によるアジドのヒュイスゲン環化付加、および歪み促進によるアジドのヒュイスゲン環化付加である。^{[10] [11] [12] [13]}

求核性リジン残基は、典型的にはアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS） エステルを介して、タンパク質バイオコンジュゲーションの一般的な標的部位です。^{[3]脱プロトン}化されたリジン残基の最適数を得るためには、水溶液のpHがリジンアンモニウム基のpKa （約10.5）より低くなければならないため、反応の典型的なpHは約8と9です。カップリング反応の一般的な試薬はNHSエステル（以下の図1の最初の反応に示す）であり、これはリジンアシル化メカニズムを介して求核性リジンと反応します。他の同様の試薬には、同様のメカニズムを受けるイソシアネートとイソチオシアネートがあります（以下の図1の2番目と3番目の反応に示す）。^[1]ベンゾイルフルオリド（図1の最後の反応で示されている）は、穏やかな条件（低温、生理学的pH）下でタンパク質のリジン修飾を可能にし、従来使用されてきたリジン特異的試薬の代替として最近提案されました。^[14]

遊離システインはタンパク質表面にほとんど存在しないため、化学選択的修飾には最適です。^{[15]塩基性条件下では、システイン残基は脱プロトン化されて}チオラート求核剤が生成され、これがマレイミドやヨードアセトアミドなどのソフト求電子剤と反応します（下の図2の最初の2つの反応を参照）。その結果、炭素-硫黄結合が形成されます。システイン残基の別の修飾は、ジスルフィド結合の形成を伴います（図2の3番目の反応を参照）。還元されたシステイン残基は外因性のジスルフィドと反応し、タンパク質上に新しいジスルフィド結合を生成します。2-チオピリドンや3-カルボキシ-4-ニトロチオフェノールなどの過剰のジスルフィドは、反応を促進するためによく使用されます。^{[1] [3]}電子不足アルキンは、他の求核性アミノ酸残基の存在下でタンパク質のシステイン残基と選択的に反応することが実証されている。アルキンの置換に応じて、これらの反応は切断可能なもの（アルキノン誘導体を使用した場合）、^[16]または加水分解的に安定なバイオコンジュゲート（3-アリールプロピオロニトリルを使用した場合、図2の最後の反応）を生成することができる。^[17]

チロシン残基は比較的反応性が低いため、バイオコンジュゲーションの一般的なターゲットではありませんでした。最近の開発により、チロシンは求電子芳香族置換（EAS）反応によって修飾でき、フェノール性ヒドロキシル基に隣接する芳香族炭素に対して選択的であることが示されました。 ^[1]これは、システイン残基をターゲットにできない場合に特に有用になります。具体的には、ジアゾニウムはチロシン残基と効果的に結合し（以下の図3の最初の反応で試薬として示されているジアゾニウム塩）、ジアゾニウム塩の4位の電子吸引置換基は反応の効率を効果的に高めることができます。4-フェニル-1,2,4-トリアゾール-3,5-ジオン（PTAD）のような環状ジアゾジカルボキシアミド誘導体は、チロシン残基への選択的なバイオコンジュゲーションが報告されています（以下の図3の2番目の反応）。^[18]アルデヒドとアニリンとの3成分マンニッヒ型反応（図3の最後の反応）も、穏やかに最適化された反応条件下では比較的チロシン選択的であることが説明されている。^[19]

天然アミノ酸残基は通常大量に存在するため、1 つの部位のみを修飾することは難しい場合が多い。タンパク質末端を標的とする戦略が開発されており、これによりタンパク質修飾の部位選択性が大幅に向上する。N 末端修飾の 1 つに、末端アミノ酸の機能化がある。N末端のセリンおよびトレオニン残基の酸化によりN 末端アルデヒドが生成され、これがさらに生体直交反応を起こすことができる (図 4の最初の反応に示す)。別の種類の修飾では、N 末端システインとアルデヒドが縮合して、高 pH でも安定なチアゾリジンが生成される (図 4の 2 番目の反応)。ピリドキサールリン酸(PLP) を使用すると、いくつかの N 末端アミノ酸がアミノ基転移を起こし、グリシンやアスパラギン酸などのN 末端アルデヒドが得られる (図 4の 3 番目の反応)。

C末端修飾の一例としては、C末端チオエステルとN末端システインとの結合であるネイティブケミカルライゲーション（NCL）が挙げられます（図5）。

ケトンまたはアルデヒドは、N末端セリン残基の酸化またはPLPによるアミノ基転移反応によってタンパク質に結合できる。さらに、ティレル法またはシュルツ法によって非天然アミノ酸を組み込むことによっても導入できる。 ^[10]次に、これらはアルコキシアミンおよびヒドラジンと選択的に縮合し、オキシムおよびヒドラゾン誘導体を生成する（それぞれ図6の1番目と2番目の反応に示されている）。この反応は、タンパク質のバイオコンジュゲーションの点で非常に化学選択的であるが、反応速度は遅い。機構研究によると、律速段階は四面体中間体の脱水であるため、脱水段階を加速するために弱酸性溶液がしばしば使用される。 ^[2]

求核触媒の導入により、反応速度を大幅に高めることができます（図7を参照）。例えば、アニリンを求核触媒として使用すると、プロトン化カル​​ボニルの密度が低いものが、プロトン化シッフ塩基の密度が高いものになります。^[20]つまり、高濃度の反応性求電子剤が生成されるのです。するとオキシム結合が容易に起こり、弱酸性条件下では反応速度が最大400倍にまで増加することが報告されています。^[20]この触媒の鍵となるのは、目的生成物と競合することなく反応性求電子剤を生成できることです。

近接官能基を利用する最近の開発により、ヒドラゾン縮合^[21]は中性pHで20 M ⁻¹ s ^{−1で進行できるようになり、一方オキシム縮合は中性pHで500-10000 M −1} s ⁻¹で触媒を添加せずに進行することが発見された。^{[22] [23]}

アジドとホスフィンのシュタウディンガー連結反応は化学生物学の分野で広く利用されている。生きた細胞や動物の中で安定したアミド結合を形成できるため、細胞膜の修飾、生体内イメージング、その他のバイオコンジュゲーション研究に応用されている。 ^{[24] [25] [26] [27]}

古典的なシュタウディンガー反応とは対照的に、シュタウディンガー連結反応は、律速段階がホスファジドの形成である二次反応である（具体的な反応機構は図9に示されている）。トリフェニルホスフィンは最初にアジドと反応して4員環遷移状態を経てアザイリドを生成し、次に分子内反応によりイミノホスホラン中間体が生成され、これが加水分解によりアミド結合を生成する。^[28]

アジドはサイズが小さく、熱力学的反応ポテンシャルが有利なため、化学選択的タンパク質修飾の一般的なターゲットとなっている。そのようなアジド反応の1つはアルキンとの[3+2]付加環化反応であるが、この反応には高温が必要であり、位置異性体の混合物が生じることが多い。

化学者カール・バリー・シャープレスが開発した改良反応では銅(I)触媒が使用され、これは末端アルキンとアジドを結合させて1,4置換1,2,3トリアゾールのみを高収率で生成する（下の図11参照）。機構研究では段階的な反応であることが示唆されている。^{[13] Cu(I)は最初に}アセチレンと結合し、次にアジドと反応して6員環中間体を生成する。このプロセスは非常に堅牢で、pH4～12の範囲で発生し、還元剤の存在下では硫酸銅(II)が触媒としてよく使用される。 [ ^13]

シュタウディンガー連結反応は大きな毒性がなく、生細胞内での適切なバイオコンジュゲーションであるが、ホスフィンの空気酸化に対する敏感性と水への溶解度の低さがその効率を著しく妨げている。銅(I)触媒によるアジド-アルキンカップリングは、生理的条件下では妥当な反応速度と効率を示すが、銅は著しい毒性を示し、生細胞内でタンパク質の機能を妨げることがある。2004年、化学者キャロリン・R・ベルトッツィの研究室は、歪みのあるシクロオクチンとアジドを用いた金属を使わない[3+2]環化付加反応を開発しました。最小の安定したシクロアルキンであるシクロオクチンは、[3+2]環化付加反応によってアジドとカップリングし、2つの位置異性体トリアゾールを生じます（図12）。^[11]この反応は室温で容易に進行するため、悪影響を与えることなく生細胞を効果的に改変するために使用できます。環状アルキンにフッ素置換基を導入すると反応速度が大幅に加速されることも報告されている。 ^{[2] [29]}

遷移金属をベースとしたバイオコンジュゲーションは、水溶液、室温、穏やかな pH、低い基質濃度など、有機金属反応にとって一般的に難しい生物学的条件の性質上、困難でした。しかし、最近では、銅触媒による [3 + 2] アジドアルキン環化付加反応に加えて、オレフィンメタセシス、アルキル化、C–H アリール化、C–C、C–S、C–Nクロスカップリング反応など、ますます多様な遷移金属媒介化学変換がバイオコンジュゲーション反応に応用されています。^{[30] [31]}

• Rh触媒によるTrpおよびCysアルキル化^{[32] [33]}

ビニル置換ジアゾ化合物をRh ₂ (OAc) ₄で活性化してその場で生成されたRh ^IIカルベノイドを使用することで、トリプトファンとシステインが水性媒体中で選択的にアルキル化されることが示されました。

しかし、この方法は立体的制約のため、表面トリプトファンとシステインに限定される可能性がある。^[34]

• イリジウム触媒によるリジンおよびN末端（還元的）アルキル化^[35]

アルデヒドとリジンまたは N 末端との縮合により生成されるイミンは、ギ酸イオン（水素化物源として機能）の存在下で、水に安定な [Cp*Ir(bipy)(H ₂ O)]SO ₄錯体によって効率的に還元できます。この反応は生理学的に関連する条件下で容易に起こり、さまざまな芳香族アルデヒドの高い変換率をもたらします。

• Pd触媒によるTyr O-アルキル化^[36]

アリル酢酸塩またはカルバメート前駆体から誘導された予め形成された求電子性π-アリルパラジウム(II)試薬を使用することにより、システインの存在下、室温で水溶液中でチロシンの選択的アリルアルキル化を達成することができる。

• Au触媒によるCysアルキル化^[37]

システイン含有ペプチドは、金(I)塩および/または銀(I)塩の存在下でアレンに1,2-付加反応を起こし、ヒドロキシル置換ビニルチオエーテルを生成することが示されています。ペプチドとの反応は高収率で進行し、他の求核残基よりもシステインに対して選択的です。

しかし、タンパク質に対する反応性は大幅に低下しており、これはおそらく金がタンパク質骨格に配位しているためと考えられます。

• Trpアリール化

トリプトファンのC-Hアリール化を達成する方法は複数報告されており、アリールハロゲン化物^{[38] [39]}やアリールボロン酸^[40]（以下に一例を示す）などの多様な求電子剤がアリール基の転移に使用されている。

しかし、現在のトリプトファン C-H アリール化反応条件は比較的厳しいままであり、有機溶媒、低 pH、および/または高温が必要になります。

• システインアリール化

遊離チオールはPd触媒の分解のため、Pd媒介反応には不利であると考えられてきた。^[41]しかし、ジアルキルビアリールホスフィン配位子に担持されたPd ^II 酸化付加錯体（OAC）は、システインのS-アリール化に効率的に作用することが示されている。

^{最初の例は、Pd II} OAC とRuPhosの使用です。^{[42]アリールハライドまたはトリフルオロメタンスルホネートの}酸化的付加から生成し、RuPhos をリガンドとして使用するPd ^II錯体は、中性 pH で 5% 有機共溶媒を含むさまざまな緩衝液中でシステインを化学選択的に修飾できます。この方法は、ペプチドやタンパク質の修飾、ペプチドの大環状化 (ビスパラジウム試薬と 2 つの保護されていないシステインを含むペプチドを使用) ^[43]、抗体薬物複合体 (ADC) の合成に効果があることが示されています。リガンドをsSPhosに変更すると、Pd ^II錯体が十分に水溶性になり、共溶媒のない水性条件下でシステイン S-アリール化を実現できます。^[44]

この方法には他の応用もあり、SPPS中に4-ハロフェニルアラニンをペプチドに導入してペプチド-ペプチドまたはペプチド-タンパク質の連結を達成することにより、Pd ^{II複合体をPd II-}ペプチドOACとして生成した。^[45]

ペプチドへの直接酸化付加の代替として、Pd OACはNHSエステルを介したアミン選択的アシル化反応によってタンパク質に転移することもできる。後者は、タンパク質（Pd ^II -タンパク質OACを形成）およびオリゴヌクレオチド（Pd ^II -オリゴヌクレオチドOACを形成）の表面リジン残基を選択的に標識するために適用されており、その後、システイン含有ペプチドまたはタンパク質に結合させることができる。^[46]

タンパク質-タンパク質クロスカップリングのもう一つの例は、分子内酸化付加戦略を利用してシステイン残基を求電子性S-アリール-Pd-X OACに変換することによって達成される。^[47]

• Lysアリール化^[48]

システインと同様に、リジンの N-アリール化は、さまざまなジアルキルビアリールホスフィン配位子を持つ Pd OAC によって達成できます。システインと比較して求核性が弱く、還元脱離速度が遅いため、支持配位子の選択が重要であることが示されています。かさばるBrettPhosおよびt -BuBrettPhos配位子と弱塩基性ナトリウムフェノキシドの組み合わせは、ペプチド基質上のリジンを官能化する戦略として使用されています。反応は穏やかな条件で起こり、他のほとんどの求核性アミノ酸残基に対して選択的です。

Pd媒介の薗頭、ヘック、および鈴木・宮浦クロスカップリング反応は、ペプチドやタンパク質の修飾に広く応用されており、水溶液への応用のために多様なPd試薬が開発されている。^{[49]これらの反応には、アルキン、 [50] [51] [52]、}アリールハライド、^{[53] [ 54 ] [55] [56]}、アリールボロン酸^[57] などの非天然官能基を有するタンパク質またはペプチド基質が必要であり、これらは遺伝暗号の拡張または翻訳後修飾 によって達成できる。

TGF-βを鉄酸化物ナノ粒子にバイオコンジュゲーションし、それを磁気ハイパーサーミアで活性化することが報告されている。^[58]これは、1-(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミドとN-ヒドロキシスクシンイミドを組み合わせて、成長因子上の遊離第一アミンと第一アミド結合を形成することによって行われた。カーボンナノチューブは、バイオコンジュゲーションと組み合わせてTGF-βを結合し、その後近赤外光で活性化するのに効果的に使用されている。^[59]通常、これらの反応には架橋剤の使用が含まれるが、これらの中には、対象化合物とベース材料の間に分子空間を追加し、その結果、非特異的結合と望ましくない反応性を高めるものもある。^[60]

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