リボソームディスプレイ

リボソームディスプレイは、試験管内で タンパク質を進化させて、目的のリガンドに結合できるタンパク質を作成するために使用される技術です。このプロセスにより、mRNA前駆体と関連した翻訳されたタンパク質が生成され、選択ステップで複合体として固定化されたリガンドに結合するために使用されます。次に、適切に結合するmRNAタンパク質ハイブリッドはcDNAに逆転写され、 PCRによって配列が増幅されます。^[1] その結果、強固に結合するタンパク質を作成するために使用できる ヌクレオチド配列が得られます。

リボソームディスプレイは、ポリペプチドをコードするDNA配列のネイティブライブラリから始まります。^[2]各配列は転写され、その後、in vitroでポリペプチドに翻訳されます。ただし、特定の結合タンパク質ライブラリをコードするDNAライブラリは、末端の前に終止コドンがないスペーサー配列に遺伝的に融合されています。終止コドンがないため、解放因子が結合して翻訳複合体の分解を引き起こすことができません。そのため、このスペーサー配列はペプチジルtRNAに付着したままリボソームトンネルを占有し、目的のタンパク質がリボソームから突き出て折りたたまれるようになります。その結果、mRNA、リボソーム、およびタンパク質の複合体が形成され、表面に結合したリガンドに結合できます。この複合体は、温度を下げ、Mg ²⁺などの陽イオンを添加することで安定化されます。

後続の結合段階、またはパンニング段階では、複合体は表面結合リガンドに導入されます。これは、リガンドを含む樹脂床を備えたアフィニティークロマトグラフィーカラム、固定化された表面結合リガンドを備えた 96 ウェルプレート、またはリガンドでコーティングされた磁気ビーズを使用するなど、いくつかの方法で実行できます。適切に結合する複合体は固定化されます。その後、タンパク質の結合モチーフと複合体を形成する高塩濃度、キレート剤、または可動性リガンドを介して結合剤を溶出すると、mRNA が解離します。その後、mRNA は cDNA に逆転写され、突然変異誘発を受け、より高い選択圧でプロセスに繰り返し投入されて、さらに優れた結合剤が単離されます。

リボソームディスプレイのプロセスでは、タンパク質前駆体を複合体に付着させることで、ヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うアッセイで一般的なマイクロアレイ/ペプチドビーズ/マルチウェル配列分離を省略し、必要なときまで配列を解読することなく、結合するタンパク質を増幅する簡単な方法を提供します。同時に、この方法は、ギャップのない配列多様性の大規模で集中したプールを生成し、これらの配列が分解したり、ハイブリダイズしたり、配列空間ギャップを作成するような方法で互いに反応したりしないようにすることに依存しています。

^抗体[3]やタンパク質治療薬^[4]のリードのエンジニアリングにおいて実績があり、現在でもこれらの分野で広く使用されています。

試験管内でのタンパク質進化の競合法としては、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、mRNAディスプレイがある。^[5]ペプチド（Mattheakis、Bhatt、Dow）試験管内で完全に実行されるため、他の選択技術に比べて2つの主な利点がある。第一に、ライブラリの多様性は細菌細胞の形質転換効率によって制限されず、試験管内に存在するリボソームと異なるmRNA分子の数によってのみ制限される。第二に、多様化ステップの後にライブラリを形質転換する必要がないため、各選択ラウンドの後にランダムな突然変異を簡単に導入できる。これにより、数世代にわたって結合タンパク質の容易な指向性進化が可能になる。

ライブラリからタンパク質を選択するための前提条件は、遺伝子型 (RNA、DNA) と表現型 (タンパク質) の結合です。リボソームディスプレイでは、この結合は、リボソーム、mRNA、および新生の正しく折り畳まれたポリペプチドからなる複合体を安定化することによって、in vitro 翻訳中に達成されます。リボソーム複合体は、表面に固定されたターゲットに結合できます。結合していない複合体は洗い流されますが、結合ポリペプチドを表示する複合体の mRNA は回収できるため、結合ポリペプチドの遺伝情報を分析に使用できます。

• mRNAディスプレイ

• Hanes, J.; Plückthun, A. (1997). 「リボソームディスプレイを用いた機能性タンパク質のin vitro選択と進化」Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 94 (10): 4937–42. doi : 10.1073/pnas.94.10.4937 . PMC  24609 . PMID  9144168.
• Lipovsek, D.; Plückthun, A. (2004). 「リボソームディスプレイとmRNAディスプレイによるインビトロタンパク質進化」J. Immunol. Methods . 290 (1–2): 51–67. doi :10.1016/j.jim.2004.04.008. PMID  15261571.
• He, M.; Taussig, M. (2007). 「真核生物リボソームディスプレイとin situ DNA回収」Nature Methods . 4 (3): 281–288. doi :10.1038/nmeth1001. PMID  17327849. S2CID  7293661.