オリゴヌクレオチド

オリゴヌクレオチドは短いDNAまたはRNA分子（オリゴマー）であり、遺伝子検査、研究、法医学において幅広い用途があります。一般的には実験室で固相化学合成によって作られ^[1]、これらの核酸の小さな断片は、ユーザーが指定した配列を持つ一本鎖分子として製造できるため、人工遺伝子合成、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、DNA配列決定、分子クローニング、分子プローブとして不可欠です。自然界では、オリゴヌクレオチドは通常、遺伝子発現の調節として機能する小さなRNA分子（例：マイクロRNA）として見つかるか、^[2]より大きな核酸分子の分解から生じる分解中間体です。

オリゴヌクレオチドは、分子全体を構成するヌクレオチド残基の配列によって特徴付けられる。オリゴヌクレオチドの長さは通常、「 -mer」（ギリシャ語のmeros、「部分」に由来）で示される。例えば、6ヌクレオチド（nt）のオリゴヌクレオチドはヘキサマーであり、25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは通常「25-mer」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、配列特異的な方法で、それぞれの相補的なオリゴヌクレオチド、DNA、またはRNAに容易に結合して、二重鎖、またはまれに高次のハイブリッドを形成する。この基本的な特性は、DNAまたはRNAの特定の配列を検出するためのプローブとしてオリゴヌクレオチドを使用するための基礎となる。オリゴヌクレオチドを使用する手順の例には、 DNAマイクロアレイ、サザンブロット、ASO分析、^[3]蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、PCR、および人工遺伝子の合成が含まれる。

オリゴヌクレオチドは2'-デオキシリボヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）で構成されており、骨格または2'糖の位置で修飾することでさまざまな薬理効果を得ることができます。これらの修飾によりオリゴヌクレオチドに新しい特性が与えられ、アンチセンス療法の重要な要素になります。^[4]^[5]

合成

オリゴヌクレオチドは、構成要素、天然または化学的に修飾されたヌクレオシドの保護されたホスホラミダイト、または程度は低いが非ヌクレオシド化合物を使用して化学的に合成される。オリゴヌクレオチド鎖の組み立ては、「合成サイクル」と呼ばれる通常の手順に従って 3' から 5' 方向に進行する。1 回の合成サイクルが完了すると、成長中の鎖に 1 つのヌクレオチド残基が追加される。各合成ステップの収率が 100% 未満であることと、副反応の発生により、プロセスの効率に実質的な限界が設定される。一般に、オリゴヌクレオチド配列は通常短い (13～25 ヌクレオチド長)。^[6]合成オリゴヌクレオチドの最大長は、200 ヌクレオチド残基を超えることはほとんどありません。目的の配列を持つ生成物を分離するには、 HPLCやその他の方法を使用できます。^[^要出典^]

化学修飾

化学的に安定した短いオリゴヌクレオチドを作成することは、ASO療法の開発における最初の課題でした。天然に存在するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを切断する酵素であるヌクレアーゼによって容易に分解され、あらゆる細胞型に豊富に存在します。^[7]また、短いオリゴヌクレオチド配列は、弱い固有の結合親和性を持ち、これが生体内での分解に寄与しています。^[8]

バックボーンの変更

ヌクレオチドのヌクレオシド有機チオリン酸（PS）類似体は、オリゴヌクレオチドにいくつかの有益な特性を与える。PSバックボーンがヌクレオチドに与える主な有益な特性は、各ヌクレオチドのジアステレオマー識別と、オリゴヌクレオチド合成に有用なホスホロチオエートヌクレオチドを含む反応を容易に追跡する能力である。 ^[9]オリゴヌクレオチドに対するPSバックボーンの修飾は、酵素による望ましくない分解からオリゴヌクレオチドを保護する。^[10]ヌクレオチドバックボーンの修飾は、ほとんどのヌクレオチドに対して比較的容易かつ正確に行うことができるため、広く使用されている。^[9]オリゴヌクレオチドの5'および3'末端の蛍光修飾は、環境に対するオリゴヌクレオチドの構造、ダイナミクスおよび相互作用を評価するために報告された。^[11]

シュガーリングの改造

オリゴヌクレオチドの医療用途に有用なもう一つの修飾は、2' 糖修飾である。2' 位の糖を修飾すると、オリゴヌクレオチドの標的結合能力が強化され、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド療法においてオリゴヌクレオチドの有効性が高まる。^[8] また、非特異的タンパク質結合が減少し、特定のタンパク質を標的とする精度が向上する。^[8] 最も一般的に使用される修飾の2つは、2'-O-メチルと2'-O-メトキシエチルである。^[8]核酸塩基の蛍光修飾も報告されている。^[11]

アンチセンスオリゴヌクレオチド

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、選択された配列に相補的なDNAまたはRNAの一本鎖である。^[6]アンチセンスRNAの場合、ハイブリダイゼーションと呼ばれるプロセスで、特定のメッセンジャーRNA鎖に結合してタンパク質の翻訳を阻害する。^{[12]アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の相補的（コーディングまたは}非コーディング）RNAを標的とするために使用できる。結合が起こると、このハイブリッドは酵素RNase Hによって分解される可能性がある。^[12] RNase HはRNAを加水分解する酵素であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドアプリケーションで使用すると、mRNA発現の80〜95％のダウンレギュレーションが生じる。^[6]

脊椎動物の遺伝子ノックダウンにモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することは、現在では発生生物学の標準技術であり、遺伝子発現や遺伝子機能の変化を研究するために使用されていますが、これはジャネット・ヒースマンがアフリカツメガエルを用いて初めて開発しました。^[13] FDA承認のモルフォリノ薬には、エテプリルセンとゴロディルセンがあります。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞株におけるインフルエンザウイルスの複製を阻害するためにも使用されています。^[14]^[15]

単一の変異タンパク質に起因する神経変性疾患は、非常に特異的なRNA配列を高い選択性で標的とし、修正する能力があるため、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の優れた標的である。^[3]ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む多くの遺伝性疾患は、誤ったRNA配列をもたらし、毒性のある生理学的効果を持つタンパク質の誤翻訳をもたらすDNAの変化に関連している。^[16]

細胞の内部化

細胞への取り込み/内部化は、依然としてオリゴヌクレオチド（ON）治療の成功に向けた最大のハードルとなっている。ほとんどの小分子薬と同様に、単純な取り込みは、ONのポリアニオン骨格と分子サイズによって妨げられる。取り込みと作用場所への細胞内輸送の正確なメカニズムは、まだほとんど明らかになっていない。さらに、ONの構造/修飾の小さな違い（前述参照）と細胞タイプの違いが、取り込みに大きな違いをもたらす。細胞表面へのONの吸着後、細胞への取り込みが異なる経路で起こると考えられている。特に、研究により、ほとんどの組織培養細胞は、非生産的な方法でASO（ホスホロチオート結合）を容易に取り込むことが示されており、これはアンチセンス効果が観察されないことを意味する。それとは対照的に、G結合受容体によって認識されるリガンドとASOの結合は、生産的な取り込みの増加につながる。^[17]その分類（非生産的対生産的）の次に、細胞の内部化は主にエネルギー依存的方法（受容体を介したエンドサイトーシス）で進行しますが、エネルギー非依存的受動拡散（ジムノシス）も排除できない可能性があります。細胞膜を通過した後、ON治療薬は初期エンドソームにカプセル化され、後期エンドソームに向かって輸送され、最終的には低pHで分解酵素を含むリソソームと融合します。 ^[18]治療機能を発揮するには、ONは分解される前にエンドソームから脱出する必要があります。現在、送達、細胞取り込み、エンドソーム脱出の問題を克服する普遍的な方法はありませんが、特定の細胞とその受容体に合わせたいくつかのアプローチが存在します。^[19]

ON治療薬を細胞認識/取り込みを担う物質に結合させると、取り込みが増加するだけでなく（上記参照）、主に1つの（理想的には既知の）メカニズムが関与するため、細胞取り込みの複雑さが減少すると考えられています。^[18]これは、例えば肝細胞の受容体を標的とするN-アセチルガラクトサミンを含む小分子ON結合体で達成されています。^[20]これらの結合体は、対応する受容体が標的細胞上で過剰発現し、標的治療につながるため、細胞取り込みの増加と標的送達を組み合わせた優れた例です（癌細胞上で過剰発現した受容体を利用する抗体薬物結合体と比較してください）。^[19]オリゴヌクレオチドの標的送達と細胞取り込みの増加のために広く使用され、精力的に研究されているもう1つの物質は抗体です。

分析技術

クロマトグラフィー

アルキルアミドはクロマトグラフィーの固定相として使用することができる。^[21]これらの相はオリゴヌクレオチドの分離のために研究されてきた。^[22]イオン対逆相高性能液体クロマトグラフィーは、自動合成後のオリゴヌクレオチドを分離および分析するために使用される。^[23]

質量分析

5-メトキシサリチル酸とスペルミンの混合物は、MALDI質量分析法におけるオリゴヌクレオチド分析のマトリックスとして使用することができます。 ^[24]エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）もオリゴヌクレオチドの質量を特徴付ける強力なツールです。^[25]

DNAマイクロアレイ

DNAマイクロアレイはオリゴヌクレオチドの有用な分析アプリケーションです。標準的なcDNAマイクロアレイと比較して、オリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションに対するより制御された特異性と、選択的スプライシングまたはポリアデニル化配列の存在と普及を測定する機能を備えています。 ^[26] DNAマイクロアレイの1つのサブタイプは、オリゴヌクレオチドが高密度に結合した基板（ナイロン、ガラスなど）として説明できます。^[27]生命科学にはDNAマイクロアレイの多くのアプリケーションがあります。 ^[要出典]

参照

アプタマー、重要な生物学的用途を持つオリゴヌクレオチド
モルフォリノ、非天然骨格を持つオリゴは、RNase-Hを活性化しないが、遺伝子発現を低下させたりRNAスプライシングを変更したりすることができる。
多型性、突然変異により同じ遺伝子が集団内に複数の形で出現すること。多くの場合、ASOプローブで検査できる。
CpGオリゴデオキシヌクレオチド、免疫刺激特性を持つODN
ポリプリン逆フーグスティーンヘアピン（PPRH）は、DNA または RNA に結合して遺伝子発現を低下させることができるオリゴヌクレオチドです。

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外部リンク

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合成