Loading article…
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（/ ɪˈlaɪzə /、/ ˌiːˈlaɪzə / ）は、一般的に使用されている分析生化学アッセイであり、 1971年にEva EngvallとPeter Perlmannによって初めて記述されました。[ 1 ]このアッセイは、測定対象のリガンド（一般的にはタンパク質）に対する抗体を使用して、液体サンプル中のリガンドの存在を検出する固相型酵素免疫測定法（EIA）です。ELISAは、医学、植物病理学、バイオテクノロジーにおける診断ツールとして、またさまざまな産業における品質管理チェックとして使用されてきました。
ELISAの最もシンプルな形式では、検査対象のサンプルから抗原を表面に固定します。次に、抗原と結合する抗体を表面に塗布します。この抗体は酵素と結合しており、結合しなかった抗体は除去されます。最終段階では、酵素の基質を含む物質を添加します。抗原が結合した場合、その後の反応によって検出可能なシグナル（最も一般的なのは色の変化）が生じます。
ELISA法では、特定の抗原に対する特異性を持つ抗体を少なくとも1種類使用します。抗原量が不明なサンプルは、固体支持体（通常はポリスチレン製マイクロタイタープレート）上に、非特異的（表面への吸着による）または特異的（サンドイッチELISA法では、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉による）に固定化されます。抗原が固定化された後、検出抗体が添加され、抗原と複合体を形成します。検出抗体は、酵素に共有結合させるか、またはバイオコンジュゲーションによって酵素に結合した二次抗体によって検出されます。各ステップの間には、通常、プレートを弱洗剤溶液で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質や抗体を除去します。最終洗浄後、酵素基質を添加してプレートを発色させ、サンプル中の抗原量を示す可視シグナルを生成します。
特筆すべき点として、ELISAは厳密には「免疫」アッセイではなく、他の形式のリガンド結合アッセイを実行できますが、この方法の開発の歴史と一般的な使用法から、当初は「免疫」という名称が付けられていました。この技術では基本的に、固相に固定化できるリガンド試薬と、特異的に結合し、酵素を使用して適切に定量化できるシグナルを生成する検出試薬が必要です。洗浄の間には、リガンドとその特異的結合相手のみが抗原抗体相互作用によって固相に特異的に結合または「免疫吸着」されたまま残り、非特異的または未結合の成分は洗い流されます。洗浄後に同じ反応ウェル（キュベットなど）を再利用できる他の分光光度計を用いたウェットラボアッセイ形式とは異なり、ELISAプレートでは反応生成物がプレートの一部である固相に免疫吸着されるため、容易に再利用できません。
分析生化学アッセイおよび「ウェットラボ」技術として、ELISAは、分析中に液体試薬を継続的に使用する方法（つまり、サンプル中の分析対象物質の量の尺度として容易に定量化および解釈できるシグナルを生成する制御された生化学反応のシーケンス）によって、液体サンプル中の分析対象物質（つまり、その存在が定量的または定性的に分析される特定の物質）を検出するものであり、反応物を封じ込めるために必要な反応チャンバーまたはウェル内に液体のまま留まります。[ 2 ] [ 3 ]これは、乾燥ストリップを使用する「ドライラボ」技術とは対照的です。サンプルが液体であっても（たとえば、測定された小さな滴）、ドライ分析の最終検出ステップは、反射測定などの方法による乾燥ストリップの読み取りであり、サンプル間のこぼれや混合を防ぐための反応封じ込めチャンバーは必要ありません。[ 4 ]
ELISAは不均一アッセイとして、分析反応混合物のいくつかの成分を物理的に固定された固相に吸着させることで分離します。ELISAでは、液体サンプルが特殊な結合特性を持つ固定固相に添加され、続いて複数の液体試薬が順次添加、インキュベート、洗浄され、その後、ウェル内の最終液体に光学的変化（例えば、酵素反応生成物による発色）が生じ、そこから分析対象物の量が測定されます。定量的な「読み取り」は通常、分光光度計による透過光の強度の検出に基づいており、液体（およびマルチウェルプレート形式のウェルの透明な底面）を通過する特定の波長の光の透過を定量化します。[ 2 ] [ 3 ]検出の感度は、分析反応中のシグナルの増幅に依存します。酵素反応はよく知られた増幅プロセスであるため、正確な定量化を可能にするために一定の比率で検出試薬に結合した酵素によってシグナルが生成され、そのため「酵素結合型」という名前が付けられています。[ 5 ]
分析対象物は、検出試薬に特異的に結合するため、リガンドとも呼ばれ、ELISAはリガンド結合アッセイというより大きなカテゴリーに分類されます。[ 2 ]リガンド特異的結合試薬は「固定化」され、通常は透明なウェルの底面、場合によっては側壁にもコーティングされ乾燥されます[ 6 ]（ここでは、洗い流すことができる固体微粒子/ビーズとは対照的に、固定された「固相」/「固体基質」です）。これは通常、「ELISAプレート」として知られるマルチウェルプレートとして構築されます。従来、他の免疫測定法と同様に、抗原抗体型の反応の特異性が利用されます。これは、試薬として抗原に対して特異的に抗体を大量に作製することが容易であるためです。あるいは、分析対象物自体が抗体である場合、その標的抗原を結合試薬として使用できます。[ 7 ]
ELISAが開発される以前は、免疫測定法を行う唯一の方法は、放射性標識抗原または抗体を使用するラジオイムノアッセイでした。ラジオイムノアッセイでは、放射能がシグナルを提供し、サンプル中に特定の抗原または抗体が存在するかどうかを示します。ラジオイムノアッセイは、1960年に発表されたロザリン・サスマン・ヤローとソロモン・バーソンの科学論文で初めて記述されました。[ 8 ]
放射能は健康に潜在的な脅威となるため、より安全な代替手段が求められた。ラジオイムノアッセイの適切な代替手段としては、放射性シグナルの代わりに非放射性シグナルを用いる方法が考えられる。酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）が適切な基質（ ABTSやTMBなど）と反応すると、色の変化が生じ、これがシグナルとして用いられる。ただし、シグナルは抗体または抗原の存在と関連付けられなければならないため、酵素を適切な抗体に結合させる必要がある。この結合プロセスは、Stratis AvrameasとGB Pierceによって独自に開発された。[ 9 ]未結合の抗体または抗原を洗浄によって除去する必要があるため、抗体または抗原を容器の表面に固定する必要がある。つまり、免疫吸着剤を調製する必要がある。これを実現する技術は、1966年にWideとJerker Porathによって発表された。 [ 10 ]
1971年、スウェーデンのストックホルム大学のピーター・パールマンとエヴァ・エングヴァル、そしてオランダのアントン・シュールスとバウケ・ファン・ウェーメンは、それぞれ独立して、この知識をEIA/ELISAを実行する方法に統合した論文を発表した。[ 11 ] [ 12 ]
従来のELISAでは、通常、抗原または分析物の存在を示すために目に見える色の変化を生じる発色レポーターと基質が使用されます。新しいELISA類似技術では、定量可能なシグナルを生成するために、蛍光レポーター、電気化学発光レポーター、および定量PCRレポーターが使用されます。これらの新しいレポーターには、感度の向上やマルチプレックス化など、さまざまな利点があります。[ 13 ] [ 14 ]技術的には、この種の新しいアッセイは厳密にはELISAではありません。なぜなら、それらは「酵素結合」ではなく、代わりに非酵素レポーターに結合しているからです。しかし、これらのアッセイの一般的な原理はほぼ同じであるため、ELISAと同じカテゴリーに分類されることがよくあります。
2012年、ナノ粒子を発色レポーターとして用いた超高感度酵素ベースのELISA検査により、わずかアトグラムの分析対象物質の検出から肉眼で色のシグナルが得られるようになった。陽性の場合は青色、陰性の場合は赤色が現れる。ただし、この検出では分析対象物質の存在または非存在のみを確認でき、実際の濃度は確認できないことに注意が必要である。[ 15 ]
特定の分子に対しては、対応する抗体を使用するELISA検査が多数あります。ELISA検査は、分析対象物と抗体の結合方法と使用方法に基づいて、いくつかの種類の検査に分類されます。 [ 16 ] [ 17 ]主な種類については、ここで説明します。[ 18 ]
直接ELISAの手順[ 19 ]
以下のメカニズムに従います。
酵素は増幅器として機能します。酵素結合抗体がわずかしか結合していなくても、酵素分子は多くのシグナル分子を生成します。常識的な範囲内では、酵素は無限に発色し続けることができますが、結合する抗体が多いほど、発色は速くなります。直接ELISAの大きな欠点は、抗原固定化法が特異的ではないことです。血清を試験抗原の供給源として使用すると、サンプル中のすべてのタンパク質がマイクロタイタープレートのウェルに付着する可能性があるため、血清中の分析対象物の濃度が低い場合、ウェル表面に結合する際に他の血清タンパク質と競合する必要があります。サンドイッチELISAまたは間接ELISAは、試験抗原に特異的な「捕捉」抗体を使用して血清の分子混合物から試験抗原を引き出すことで、この問題を解決します。
ELISAは定性または定量形式で実施できます。定性結果では、サンプルに対して単純に陽性または陰性（はいまたはいいえ）の結果が得られます。陽性と陰性の境界は分析者によって決定され、統計的な値を用いる場合があります。陽性サンプルと陰性サンプルを区別するために、標準偏差（テストに内在する誤差）の2倍または3倍がよく用いられます。定量ELISAでは、サンプルの吸光度（OD）を標準曲線と比較します。標準曲線は通常、既知濃度の標的分子溶液を段階希釈したものです。例えば、テストサンプルのODが1.0の場合、OD =1.0となる標準曲線上の点は、サンプルと同じ分析対象物質濃度でなければなりません。
「間接ELISA」と「直接ELISA」という名称の用法と意味は、実験の文脈によって文献やウェブサイトで異なっています。抗原の存在を分析する場合、「直接ELISA」とは標識された一次抗体のみを使用するELISAを指し、「間接ELISA」とは抗原が一次抗体に結合し、その後標識された二次抗体によって検出されるELISAを指します。後者の場合、サンドイッチELISAは間接ELISAとは明らかに異なります。免疫分析など、「一次」抗体が関心の対象となる場合、この抗体は二次抗体によって直接検出され、「間接ELISA」という用語は2つの抗体を使用する設定に適用されます。
サンプル抗原の検出には「サンドイッチ」ELISA法が用いられる。[ 20 ]手順は以下のとおりである。
右の画像には、酵素に結合した二次抗体の使用が含まれていますが、技術的には、一次抗体が酵素に結合している場合（直接ELISAの場合）は、これは不要です。しかし、二次抗体コンジュゲートを使用することで、検出したい抗原ごとに酵素結合抗体を作成するという高価なプロセスを回避できます。他の抗体のFc領域に結合する酵素結合抗体を使用することで、この同じ酵素結合抗体をさまざまな状況で使用できます。最初の「捕捉」抗体層がない場合、サンプル中のタンパク質（血清タンパク質を含む）がプレート表面に競合的に吸着し、固定化される抗原の量が減少します。精製された特異抗体を使用して抗原をプラスチックに結合させることで、測定前に複雑な混合物から抗原を精製する必要がなくなり、アッセイが簡素化され、アッセイの特異性と感度が向上します。したがって、研究で使用されるサンドイッチELISAは、偽陽性結果のリスクを減らすために、多くの場合検証が必要です。[ 21 ]
ELISAの3つ目の用途は、競合結合によるものです。このELISAの手順は、最初の2つの例とは若干異なります。
標識されていない抗体を、その抗原（サンプル）の存在下でインキュベートする。
競合型ELISAキットの中には、酵素結合抗体ではなく酵素結合抗原を含むものがあります。標識された抗原は、サンプル中の抗原（非標識）と一次抗体の結合部位をめぐって競合します。サンプル中の抗原量が少ないほど、ウェル内に保持される標識抗原の量が多くなり、シグナルが強くなります。
通常、抗原は最初にウェル内に配置されません。
HIV抗体の検出には、マイクロタイタープレートのウェルにHIV抗原をコーティングします。2種類の特異抗体を使用し、1つは酵素と結合させたもので、もう1つは血清中に存在する抗体です（血清が抗体陽性の場合）。同じ抗原に対して2種類の抗体が競合し、より強いシグナルが観察されます。検査対象の血清をこれらのウェルに添加し、37 ℃でインキュベートした後、洗浄します。抗体が存在する場合、抗原抗体反応が起こります。酵素標識された特異的HIV抗体に対しては抗原が残っていません。これらの抗体は添加時に遊離した状態で存在し、洗浄中に洗い流されます。基質を添加しますが、基質に作用する酵素がないため、陽性結果では色の変化は見られません。
4つ目のELISA検査では、従来のウェルを使用せず、抗原を検査液中に懸濁させたままにする。[ 22 ] [ 23 ]
この検査では、複数の抗原を同時に標識して計数することができます。これにより、2つ（またはそれ以上）の異なる色の標識によって特定の細菌株を識別することが可能です。細胞上に両方の標識が存在する場合、その細胞はその特定の細菌株です。片方の標識しか存在しない場合は、その細菌株ではありません。
この検査は通常、一度に1つの検査しか行えず、マイクロタイタープレートでは実施できません。必要な機器は通常、比較的単純で、現場でも使用できます。
以下の表は、ELISAアッセイで一般的に使用される酵素マーカーの一覧です。これらのマーカーを用いることで、アッセイ完了後に結果を測定することができます。
ELISAは、サンプル中の抗原または抗体の存在を評価するために実施できるため、血清抗体濃度の測定に有用なツールです（HIV検査[ 26 ]やウエストナイルウイルスなど）。また、食品業界では、牛乳、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、卵などの潜在的な食物アレルゲンの検出[ 27 ]や、セリアック病の血清学的血液検査[ 28 ] [ 29 ]にも応用されています。ELISAは、毒性学において、特定の種類の薬物の迅速な推定スクリーニングとしても使用できます。
ELISAは、その高い感度から、HIVのスクリーニング検査として広く用いられるようになった最初の検査法です。ELISAでは、被験者の血清を400倍に希釈し、HIV抗原が結合したプレートに塗布します。血清中にHIVに対する抗体が存在する場合、これらの抗体はHIV抗原に結合する可能性があります。次に、プレートを洗浄して血清中の他の成分をすべて除去します。その後、特別に調製された「二次抗体」（他の抗体に結合する抗体）をプレートに塗布し、再度洗浄します。この二次抗体は、あらかじめ酵素と化学的に結合されています。
したがって、プレートには、プレートに結合した二次抗体の量に比例した酵素が含まれる。酵素の基質が添加され、酵素による触媒作用によって色または蛍光が変化する。ELISAの結果は数値で報告される。この検査で最も議論の的となっているのは、陽性と陰性の結果を区別する「カットオフ」ポイントを決定することである。
カットオフポイントは、既知の標準値と比較することで決定できます。 例えば、職場での薬物スクリーニングにELISA検査を用いる場合、カットオフ濃度として50 ng/mlを設定し、その標準濃度の分析対象物質を含むサンプルを調製します。既知のサンプルよりも強いシグナルを示す未知サンプルは「陽性」、弱いシグナルを示す未知サンプルは「陰性」と判定されます。
ELISA検査は、デング熱、マラリア、シャーガス病[ 30 ] 、ヨーネ病[ 31 ]など、さまざまな病気を検出するために用いられています。ELISA検査は、医療検査室における体外診断にも広く利用されています。ELISAのその他の用途には、次のものがあります。
eSimoa（酵素結合型単一分子アレイ）は、臨床診断や研究で広く利用されている従来のELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）技術の大きな進化を表しています。eSimoaは、生体分子検出の感度と解像度を大幅に向上させることで、ELISAの機能を拡張し、従来の標準的なアッセイでは達成できなかった濃度での生体分子の検出を可能にします。[ 34 ]
ELISAの基本原理に基づき、eSimoaは常磁性ビーズを用いて、ELISAのプレートベースの検出と同様の方法で生体分子や酵素を分離します。しかし、eSimoaはこの概念をさらに発展させ、単一分子レベルでの酵素反応測定を可能にすることで、様々な酵素や生体分子の検出限界を劇的に向上させます。この方法により、低存在量のタンパク質や、プロテインキナーゼやテロメラーゼといった重要な酵素の活性を正確に定量することが可能になります。これらの酵素は、従来のELISAでは検出限界を下回ることが多いものです。
eSimoaの感度向上は、臨床診断におけるバイオマーカーの早期かつ正確な検出に不可欠であり、疾患のモニタリングと管理の向上に貢献します。創薬においては、酵素活性の微細な変化を追跡できる能力は、酵素阻害メカニズムに関する詳細な知見を提供することで、より効果的な医薬品の開発に役立ちます。
eSimoa で見られるオリジナルの研究は、ハーバード大学の David R. Walt のチームによって行われ、2020 年にその研究成果が発表されました[ 34 ] [ 35 ]。しかし、この技術の開発に関する主張は、国立台湾大学 (NTU) の Chi-An Cheng によって 2023 年と 2024 年に異議を唱えられており、彼女は自分のチームがこの技術を開発したと主張しています[ 36 ] [ 37 ] 。