細菌の展示

バクテリアディスプレイ（またはバクテリアディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ）は、 in vitro タンパク質進化に使用されるタンパク質工学技術です。バクテリアの表面に表示されるポリペプチドのライブラリは、フローサイトメトリーまたは反復選択手順（バイオパニング）を使用してスクリーニングできます。このタンパク質工学技術により、タンパク質の機能とそれをコードする遺伝子を結び付けることができます。バクテリアディスプレイは、望ましい特性を持つ標的タンパク質を見つけるために使用でき、細胞特異的な親和性リガンドを作成するために使用できます。このシステムは、新しいワクチンの作成、酵素基質の特定、標的タンパク質に対するリガンドの親和性の検出など、多くの用途に使用できます。

細菌ディスプレイは、磁気活性化細胞選別（MACS）または蛍光活性化細胞選別（FACS）技術と組み合わせられることが多い。in vitroでのタンパク質進化の競合方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびmRNAディスプレイである。バクテリオファージディスプレイは、使用されるディスプレイシステムの中で最も一般的に使用されているが^[1]、技術的な課題が克服されるにつれて、細菌ディスプレイの人気が高まっている。FACSと組み合わせた細菌ディスプレイには、リアルタイム技術であるという利点もある。

細胞ディスプレイシステムは、1985年に初めて使用され、ペプチドがM13バクテリオファージ上に表示されたタンパク質と遺伝的に融合されました。バクテリオファージディスプレイは、一般的に使用されている細胞ディスプレイシステムですが、表示できるタンパク質のサイズに制限があります。その後、1986年に細菌ディスプレイが導入され、より大きなタンパク質の表面ディスプレイが可能になりました。細菌ディスプレイシステムは、1986年にFreudlらとCharbitらによって初めて導入され、細菌表面タンパク質OmpAとLamBを使用してペプチドを表示しました。Freudlらは、リンカー付きのペプチドをompA遺伝子と融合し、ペプチドがOmpAタンパク質で発現するようにしました。彼らは、タンパク質がプロテイナーゼKによって切断されるようになったことを示しました。したがって、挿入された非OmpAペプチドは、プロテイナーゼKのターゲットでした。外来ペプチドの挿入は、細菌細胞の増殖に影響を与えませんでした。まず、LamBタンパク質の外来ペプチド挿入が「許容される」領域（つまり、タンパク質の機能が完全に失われない領域）を定義しました。次に、三量体外膜ポリンの表面に露出したループに位置する許容部位（サイズ制限、エピトープの性質など）の汎用性を調査し、多価生細菌ワクチンの開発を目指しました（12-15）。これは、細胞の機能を変えることなく、細胞の表面でタンパク質を発現するために細菌表面ディスプレイ技術を使用した最初の証拠でした。^[2]

ペプチドは治療薬や診断薬として非常に有用である。その使用はますます一般的になりつつあり、ディスプレイシステムはペプチドを設計し、その結合能力を最適化するための有用な方法を提供する。細胞は、他の細胞の認識、他の細胞との相互作用、細胞シグナル伝達など、さまざまな応答に関与する可能性のある表面タンパク質を発現する。多くの種類の細菌は、宿主細胞への結合に関与する腸管病原性大腸菌 のインチミンタンパク質や、外膜の構造を維持するのに重要な大腸菌細胞のOmpAタンパク質などの細胞表面タンパク質を有する。[3]多くの表面タンパク質は、細菌細胞の付着と宿主細胞への侵入に関与している。細菌ディスプレイを使用することで、宿主細胞上の標的タンパク質を特定することができる。これらの表面タンパク質は、まず細菌細胞膜を越えて細胞質から細胞表面に転座される必要がある。^グラム陰性細菌には、グラム陽性細菌にはない追加の細胞周腔があるため、タンパク質を転座させる作業がより困難になる。細菌細胞表面上に異種タンパク質を発現させるには、通常、タンパク質とスキャフォールドと呼ばれる表面タンパク質との融合が必要です。

スキャフォールドは細菌細胞表面に異種タンパク質を提示​​するために使用されます。外膜タンパク質、線毛/鞭毛タンパク質、CPX（環状置換OmpX）など、さまざまなスキャフォールドが使用されています。^[4] CPXスキャフォールドは、スキャフォールドの両端でペプチド融合を可能にします。

OMP は細菌ディスプレイの一般的な足場です。オートトランスポーターを使用することで、細菌細胞表面にタンパク質を表示することもできます。オートトランスポーターは V 型分泌システムの一部を形成します。通常、N 末端のリーダー配列、中央パッセンジャードメイン、C 末端のオートトランスポータードメインの 3 つのドメインがあります。異種タンパク質はパッセンジャードメインに挿入されます。^{[5]異種タンパク質融合の別の方法は、細胞表面の糸状突起である}線毛/鞭毛との融合です。主にグラム陰性細菌には多くの線毛があるため、線毛上にタンパク質を表示することは、数が少ない他の表面タンパク質よりも有利です。線毛を使用することの欠点は、挿入サイズの制限が 10 ～ 30アミノ酸と比較的小さいことです。^[6]

異種タンパク質が細菌細胞表面タンパク質と融合されると、実験の用途に応じて、酵素、細胞（標的タンパク質を発現している）、または抗体（通常は蛍光タグ付き）のいずれかにさらされます。次に、サンプルは、FACS 中に、一度に 1 つの細胞のみが通過できる非常に狭い流体の流れの中で光線を通過させ、放出された蛍光を検出します。細胞のサイズに関する情報は、光の散乱によって得られ、異種タンパク質が標的タンパク質/細胞と結合している場合は、より多くの蛍光が放出されます。

細菌表面ディスプレイは、親和性スクリーニング、抗体エピトープマッピング、ペプチド基質の同定、細胞結合ペプチドの同定、ワクチン生成など、さまざまな用途に使用できます。 ^[7]

スクリーニングは、細菌細胞表面に表示される異種タンパク質と標的タンパク質との見かけの親和性を調べるために使用されます。この方法は通常、FACS と組み合わせて使用​​され、非蛍光標的タンパク質競合物質を追加すると、より正確な結合親和性が得られます。競合物質を追加すると、標的タンパク質が再結合する可能性が減り、結合親和性の精度が低下します。

環状ペプチドは細菌細胞表面にうまく表示することができます。^[8] DNAランダム化により、細胞表面に表示された何百万もの環状ペプチドを、高スループットFACSを使用してタンパク質ターゲットに対してスクリーニングすることができます。^[9]

抗体エピトープマッピングは抗体の特異性を調べるために使用されます。エピトープ（抗原の抗体結合部位）は、抗原をコードする遺伝子の領域を発現させることによって細菌細胞表面に発現します。蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーは、エピトープに結合する抗体の量を検出するために使用されます。^[10]

これは、タンパク質分解酵素に最適な基質を見つけるために適用できます。基質は、親和性リガンドと足場の間の細菌細胞表面に表示され、基質タンパク質分解の速度論は FACS を使用して測定されます。

細菌ディスプレイは、乳がん細胞や幹細胞などの特定の細胞に結合するペプチドを見つけるために使用できます。ディスプレイされたタンパク質はGFPで蛍光タグが付けられているため、ペプチドと標的細胞間の結合相互作用をフローサイトメトリーで確認できます。ディスプレイされたペプチドがない場合の蛍光レベルを測定するには、コントロールサンプルが必要です。ディスプレイされたペプチドを含まないが、哺乳類細胞と細菌細胞 (スキャフォールドを含む) を含むサンプルも必要です。

ワクチンの投与は、細菌表面ディスプレイの非常に一般的な用途です。製造可能な生細菌ワクチンには 2 つのタイプがあります。

1. 通常、病原菌は弱毒化されるため、病原性はなくなります。
2. 病原性のない常在細菌または食品用細菌。

細菌表面抗原ディスプレイの使用は、さまざまな理由から従来のワクチン設計に代わる価値ある選択肢である。その理由の1つは、細菌細胞表面に発現したタンパク質がアジュバントとして有利に作用する可能性があることである。従来のワクチンはアジュバントの添加を必要とする。細菌ディスプレイシステムを使用してワクチンを生成するもう1つの利点は、細菌細胞全体を生ワクチンに組み込むことができることである^[11 ] 。ワクチン開発で一般に未知のエピトープを見つけるために使用されるバクテリオファージディスプレイシステムとは異なり、細菌ディスプレイシステムは既知のエピトープを発現するために使用され、細胞はワクチン送達システムとして機能する。^[12]

同様の条件下では、細菌に表示されたペプチドをモデルタンパク質ストレプトアビジンとして選択すると、さらに悪い結果となった。^[13]

12. Charbit A、Boulain JC、Ryter A、Hofnung M. 外来エピトープの遺伝子挿入による細菌膜タンパク質のトポロジーの調査、細胞表面での発現。EMBO J. 1986年11月;5(11):3029-37。

13. Charbit A, Sobczak E, Michel ML, Molla A, Tiollais P, Hofnung M. 生きた組み換え細菌におけるB型肝炎ウイルスのpreS2領域の2つのエピトープの提示。J Immunol. 1987年9月1日;139(5):1658-64。

14. Charbit A、Molla A、Saurin W、Hofnung M.グラム陰性細菌の表面で外来ポリペプチドを発現するためのベクターの汎用性。Gene.1988年10月15日;70(1):181-9。

15. Newton SM、Klebba PE、Michel V、Hofnung M、Charbit A. エピトープタグ付けによる膜タンパク質LamBのトポロジーとX線モデルとの比較。J Bacteriol. 1996年6月;178(12):3447-56。