ポリクローナル抗体

ポリクローナル抗体(pAbs) は、体内の異なるB 細胞系統から分泌される抗体です (モノクローナル抗体は単一の細胞系統に由来します)。これらは、特定の抗原に反応し、それぞれが異なるエピトープを識別する免疫グロブリン分子の集合体です。

ポリクローナル抗体を作製する一般的な手順は次のとおりです。

1. 抗原調製
2. アジュバントの選択と準備
3. 動物の選択
4. 注入プロセス
5. 血清抽出

抗原/アジュバント複合体を選択した動物に注射して、増幅された免疫反応を開始します。特定の期間にわたって注射を繰り返すと、動物は複合体に対する抗体を生成することが期待されます。次に、動物から血液を抽出して精製し、目的の抗体を取得します。

接種は、マウス、ウサギ、ヤギなどの適切な哺乳動物に行われます。採取できる血清の量が多いため、大型の哺乳動物が好まれることが多いです。抗原を哺乳動物に注入します。これにより、Bリンパ球が抗原に特異的なIgG 免疫グロブリンを産生します。このポリクローナル IgG は、哺乳動物の血清から精製されます。

対照的に、モノクローナル抗体は単一の細胞株から生成されます。

実験動物におけるポリクローナル抗体の生産には、多くの方法論が存在します。動物の使用とこれらの方法論に関連する手順を管理する機関のガイドラインは、一般的に、アジュバント（他の薬剤の効果を変更するが、単独で投与された場合は直接的な影響はほとんどない薬剤）の使用に対する人道的配慮と適切な行動を中心に据えています。これには、アジュバントの選択、投与経路と部位、部位あたりの注射量、動物あたりの部位数が含まれます。機関のポリシーには、一般的に、1 回の採血あたりの許容血液量、動物や職員の傷害防止のための動物の適切な拘束と鎮静または麻酔などの安全対策が含まれます。

実験動物における抗体生産の主な目的は、実験や診断テストで使用するための高力価、高親和性の抗血清を得ることです。アジュバントは、抗原に対する免疫反応を改善または強化するために使用されます。ほとんどのアジュバントは、抗原を排出リンパ節にゆっくりと放出する注射部位、抗原デポを提供します。

多くのアジュバントには、以下の成分が含まれているか、直接以下の働きをします。

1. 広い表面積にわたってタンパク質抗原分子の濃縮を促進する界面活性剤、および
2. 免疫刺激分子または特性。アジュバントは一般に、可溶性タンパク質抗原とともに使用され、抗体価を高め、記憶を伴う長期の反応を誘発します。

このような抗原自体は、一般的に免疫原として不十分です。ほとんどの複合タンパク質抗原は、免疫応答中に複数の B 細胞クローンを誘導するため、応答はポリクローナルです。非タンパク質抗原に対する免疫応答は、一般的に不十分であるか、アジュバントによって強化され、システム メモリはありません。

現在、抗体はヒト B リンパ球の分離から生産され、特定の組み換えモノクローナル抗体混合物が生産されています。バイオテクノロジー企業Symphogen は、治療用途向けにこのタイプの抗体を開発しています。同社は、ポリクローナル抗体薬の多様性を模倣したモノクローナル抗体混合物で第 2 相試験に到達した最初の研究企業です。この生産は、ウイルスやプリオンの伝染を防ぐもので、プロセスは単純です。

ポリクローナル抗体の生産によく使用される動物には、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、ヒツジなどがあります。ただし、この目的に最もよく使用される実験動物はウサギです。動物の選択は、次の点に基づいて行う必要があります。

1. 必要な抗体の量、
2. 抗原の提供者と抗体産生者の関係（一般的に系統関係が遠いほど、高力価の抗体反応の可能性が高くなる）および
3. 作成する抗体の必要な特性 [例: クラス、サブクラス (アイソタイプ)、補体結合性]。免疫化と瀉血はストレスを伴うため、少なくともウサギやげっ歯類を使用する場合は、特定病原体フリー (SPF) 動物が好まれます。このような動物を使用すると、病原体、特にウサギのPasteurella multocidaによる罹患率と死亡率を大幅に減らすことができます。

大量の抗血清が必要な場合、ヤギやウマが一般的に使用されます。多くの研究者は、哺乳類との系統的距離からニワトリを好みます。ニワトリは大量の IgY (IgG) を卵黄に移し、卵から抗体を採取することで侵襲的な採血手順が不要になります。1 週間分の卵には、1 週間の採血で得られるウサギの血液量の 10 倍の抗体が含まれている場合があります。ただし、免疫測定法で特定のニワトリ由来抗体を使用する場合、いくつかの欠点があります。ニワトリ IgY は哺乳類の補体成分 C1 を固定せず、標準溶液を使用して沈降抗体として機能しません。

モノクローナル抗体の生産にはマウスが最もよく使用されますが、マウスはサイズが小さいため、十分な量のポリクローナル血清抗体を得るのに通常はマウスを使用することができません。ただし、マウスのポリクローナル抗体は、腹水生成方法の 1 つを使用して腹水から採取できます。

ウサギを使用する場合、抗体反応が活発なため、一次免疫には若い成体動物 (2.5～3.0 kg または 5.5～6.5 ポンド) を使用する必要があります。免疫機能は思春期にピークに達し、新しい抗原に対する一次反応は加齢とともに低下します。メスのウサギはより従順で、オスよりも免疫反応が活発であると報告されているため、一般的に好まれます。近交系動物を使用する場合は、抗原ごとに少なくとも 2 匹の動物を使用する必要があります。この原則により、個々の動物が抗原に反応しないことで生じる完全な失敗の可能性が軽減されます。

タンパク質抗原の大きさ、凝集の程度、相対的な天然性は、産生される抗体の質と量に劇的な影響を与える可能性があります。小さなポリペプチド（< 10  kDa）および非タンパク質抗原は、通常、免疫原性を高めてT 細胞エピトープを提供するために、より大きな免疫原性のキャリアタンパク質と結合または架橋する必要があります。一般的に、免疫原性タンパク質は大きいほど良いです。タンパク質が大きいほど、少量でも、通常、抗原提示抗原処理細胞との結合が良くなり、満足のいく免疫応答が得られます。可溶性の非凝集タンパク質を注射すると、満足のいく抗体応答よりも耐性を誘発する可能性が高くなります。

キーホールリンペットヘモシアニン(KLH) とウシ血清アルブミンは、広く使用されている 2 つのキャリアタンパク質です。ポリ-L-リジンもペプチドのバックボーンとして効果的に使用されています。ポリ-L-リジンを使用すると、外来タンパク質に対する抗体の生成が減少または排除されますが、ペプチド誘導性抗体生成が失敗する可能性があります。最近では、リポソームも小さなペプチドの送達に効果的に使用されており、この技術は油性エマルジョンアジュバントによる送達の代替手段です。

免疫化のための抗原量の選択は、抗原と選択したアジュバントの特性によって異なります。一般に、高力価の抗体を誘発するには、アジュバント内のマイクログラムからミリグラムの量のタンパク質が必要です。抗原の投与量は、一般的に体重ではなく種によって異なります。それぞれの種のいわゆる免疫原性の「ウィンドウ」は広いですが、抗原が多すぎたり少なすぎたりすると、満足のいく体液性反応ではなく、細胞性免疫への寛容、抑制、または免疫偏向を引き起こす可能性があります。特定の種の免疫化に最適な通常のタンパク質抗原レベルは、次の範囲であると報告されています。

1. ウサギ、50～1000μg
2. マウス、10～50μg
3. モルモット、50～500μg；および
4. ヤギ、250～5000μg。

最適な「プライミング」用量は、各範囲の下限にあると報告されています。

血清抗体の親和性は、抗原アジュバント混合物の注入後、時間とともに（数か月）、またシステム内の抗原が減少するにつれて増加します。「ブースター」または二次免疫に広く使用されている抗原投与量は、通常、プライミング投与量の半分です。抗原には、ポリアクリルアミドゲル、SDS、尿素、エンドトキシン、粒子状物質、極端な pH 値などの調製副産物や化学物質が含まれていてはなりません。

ペプチドを使用して抗体を生成する場合、抗原を適切に設計することが極めて重要です。設計に役立つリソースや、このサービスを提供する企業がいくつかあります。Expasy は、ProtScale ページに、操作にある程度ユーザー知識を必要とする一連の公開ツールを集約しています。よりシンプルなペプチド スコアリング ツールとして、Antigen Profiler ツールがあります。このツールを使用すると、抗体を生成するために使用された以前の免疫原の関連エピトープ マッピング データベースに基づいて、個々のペプチド シーケンスをスコアリングできます。最後に、一般的なルールとして、ペプチドはいくつかの基本的な基準に従う必要があります。

合成および免疫化のためにペプチドを検査する場合、潜在的な合成上の問題のため、特定の残基および配列を避けることが推奨されます。これには、より一般的な特性のいくつかが含まれます。

• 同じアミノ酸の非常に長い繰り返し（例：RRRR）
• セリン（S）、トレオニン（T）、アラニン（A）、バリン（V）の二重結合
• プロリン（P）で配列を終了または開始する
• N末端のグルタミン（Q）またはアスパラギン（N）
• 疎水性残基が過剰に含まれたペプチド (例: V、A、L、I など)

研究者は、免疫原として使用される場合のタンパク質抗原の生来の状態と、生成された抗体との反応も考慮する必要があります。生来のタンパク質に対する抗体は生来のタンパク質と最もよく反応し、変性タンパク質に対する抗体は変性タンパク質と最もよく反応します。誘発された抗体を膜ブロット (変性条件にかけられたタンパク質) に使用する場合は、変性タンパク質に対して抗体を作成する必要があります。一方、抗体を生来のタンパク質と反応させるか、タンパク質の活性部位をブロックするために使用する場合は、生来のタンパク質に対して抗体を作成する必要があります。アジュバントは、タンパク質の生来の状態を変えることがよくあります。一般に、事前に形成された水中油型エマルジョンアジュバントに吸収されたタンパク質抗原は、油中水型エマルジョンのアジュバントよりも、より大きな生来のタンパク質構造を保持します。

抗原は、常に微生物汚染がないことを確認する技術を使用して調製する必要があります。ほとんどのタンパク質抗原調製物は、0.22 μm フィルターを通過させることで滅菌できます。汚染された調製物を使用すると、動物の接種部位に敗血症性膿瘍が発生することがよくあります。これにより、標的抗原に対する免疫が失敗する可能性があります。

市販の免疫アジュバントは数多くあります。特定のアジュバントまたはタイプの選択は、研究や抗体製造に使用するのか、ワクチン開発に使用するのかによって異なります。ワクチン用のアジュバントは防御抗体と良好な全身記憶を生成すればよく、抗血清製造用のアジュバントは高力価、高親和性の抗体を迅速に誘導する必要があります。すべての目的に理想的な単一のアジュバントはなく、すべてに長所と短所があります。アジュバントの使用は一般に、さまざまな重症度と期間の望ましくない副作用を伴います。新しいアジュバントの研究では、毒性が最小限で免疫刺激が最大限に保たれる物質に焦点が当てられています。研究者は、実験動物でのアジュバントの使用に伴う潜在的な痛みや苦痛を常に認識しておく必要があります。

抗体生産に最も頻繁に使用されるアジュバントは、フロイント、ミョウバン、Ribi アジュバント システム、および Titermax です。

ジゴキシン免疫Fabは、タンパク質に結合したハプテンとしてジギタリス誘導体に対して生成されたポリクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、生命を脅かすジゴキシンまたはジギトキシンの毒性を逆転させるために使用されます。^{[1] [2] [3]}

Rho(D)免疫グロブリンは、D抗原に対する抗体を持つRh陰性ドナーから提供されたプールされたヒト血漿から作られます。これは、抗原の受動免疫結合を提供し、新生児の溶血性疾患を引き起こす可能性のある母親の能動免疫反応を防ぐために使用されます。^{[4] [5]}

ロズロリムパブは、 25 種類のユニークなIgG1抗体から構成される抗RhD組み換えヒトポリクローナル抗体であり、免疫血小板減少性紫斑病の治療およびRh 陰性妊婦 における同種免疫の予防に使用されます。

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) – COVID-19患者に対する潜在的な治療薬であり、 SARS-CoV-2コロナウイルス感染を予防する薬。

ポリクローナル抗体 (pAbs) をモノクローナル抗体よりも使用すると、利点があります。ポリクローナル抗体の製造に必要な技術はそれほど要求されません。製造コストが安く、かなり迅速に生成でき、製造に数か月かかることもあります。PAbs は不均一であるため、幅広い抗原エピトープに結合できます。PAbs は多数の B 細胞クローンから生成されるため、特定の抗原にうまく結合する可能性が高くなります。PAbs は pH や塩分濃度の変化など、さまざまな環境で安定しているため、特定の手順でより適用できます。さらに、必要な量に応じて、PAbs は使用する動物のサイズに応じて大量に製造できます。^{[6] [7] [8]}

ポリクローナル抗体をモノクローナル抗体よりも使用する場合の欠点は、主に再現性に関するものです。^[9] pAbs は抗原に対する免疫反応によって生成されます。個々の動物または人間は、同じ抗原に対して異なる抗体を生成します。同じ抗原に複数回さらされた場合、pAbs 混合物は時間の経過とともに変化します。このいわゆる「バッチ間」の変動は、pAbs を使用する際の最大の懸念事項の 1 つです。

欠点はあるものの、ポリクローナル抗体の幅広いエピトープ認識^[10]と高い感度^[11]は、さまざまな用途で重要です。科学者は、モノクローナル抗体(mAbs) の混合物を使用して pAbs を模倣します。mAbs の組み換え生産により、pAbs の変動性と再現性の問題が解決されました。多くの mAbs を混ぜることで、pAbs のより幅広いエピトープ認識と高い感度を模倣できます。^[12]最近の技術の進歩により、ヒトおよび免疫動物からのポリクローナル抗体タンパク質を直接配列決定できるようになりました。^{[13] [14]}これらの抗体タンパク質は、免疫システムによって生成された元の pAbs を模倣するように組み換え生産できます。

• 血漿B細胞
• クローン（B細胞生物学）
• ポリクローナル反応

• ポリクローナル抗体療法に関するネイチャーニュースの記事
• 抗原性の免疫学的測定（オンライン教科書、セクション 11.1 を参照）
• 細胞および分子生物学辞典のポリクローナル抗体
• openwetware での抗体の生成 (研究者向けの技術説明)
• ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体