指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化

SELEX の最初のステップでは、定義済みの領域に挟まれた、ある長さの完全または部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチド配列を合成します。これにより、ランダム化された領域の PCR 増幅が可能になり、RNA SELEX の場合は、ランダム化された配列の in vitro 転写が可能になります。^{[ 2 ] [ 3 ] [ 12 ]}エリントンとショスタクは、1990 年の in vitro 選択に関する論文で、化学合成によりオリゴヌクレオチド ライブラリー用に約 10 ^{15 個}のユニークな配列を生成できることを示しましたが、 ^{[ 3 ]}これらの合成されたオリゴヌクレオチドの増幅により、PCR バイアスと合成された断片の欠陥により、プールの多様性が大幅に失われることがわかりました。^{[ 3 ]}オリゴヌクレオチド プールは増幅され、初期ライブラリーの十分な量が反応に添加され、各個々の配列のコピーが多数存在するため、確率的イベントによる潜在的な結合配列の損失が最小限に抑えられます。^{[ 3 ]}ライブラリーをインキュベーションと選択的保持のために標的に導入する前に、配列ライブラリーを一本鎖オリゴヌクレオチドに変換して、標的結合特性を持つ構造コンフォメーションを実現する必要があります。^{[ 2 ] [ 3 ]}

標的導入の直前に、一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーは、オリゴヌクレオチドを熱力学的に安定な二次構造および三次構造に再構成するために、しばしばゆっくりと加熱および冷却されます。^{[ 3 ] [ 7 ]}準備されたランダム化ライブラリーは、固定化された標的とともにインキュベートされ、オリゴヌクレオチドと標的の結合が可能になります。この標的インキュベーションステップには、標的の固定化方法とそれに続く未結合オリゴヌクレオチドの分離戦略、インキュベーション時間と温度、インキュベーションバッファー条件、および標的とオリゴヌクレオチドの濃度など、いくつかの考慮事項があります。標的固定化方法の例としては、アフィニティークロマトグラフィーカラム^{[ 3 ]} 、ニトロセルロース結合アッセイフィルター^{[ 2 ]}、および常磁性ビーズ^{[ 7 ]}などがあります。最近では、SELEX反応が開発され、標的はほぼ完全なコンフルエンスまで増殖させた全細胞であり、培養プレート上でオリゴヌクレオチドライブラリーとともにインキュベートされます。^{[ 13 ]}インキュベーションバッファー条件は、選択したアプタマーの目的のターゲットと望ましい機能に基づいて変更されます。たとえば、負に帯電した小分子やタンパク質の場合、高塩バッファーを使用して電荷スクリーニングを行い、ヌクレオチドがターゲットに接近して特異的な結合イベントの可能性を高めます。^{[ 3 ]}あるいは、望ましいアプタマー機能が、潜在的な治療または診断用途のための生体内タンパク質または全細胞への結合である場合、生体内血漿塩濃度および恒常温度に類似したインキュベーションバッファー条件は、生体内で結合できるアプタマーを生成する可能性が高くなります。インキュベーションバッファー条件におけるもう1つの考慮事項は、非特異的競合物質です。反応条件で非特異的なオリゴヌクレオチドが保持される可能性が高い場合、SELEXライブラリー以外の、ライブラリーオリゴヌクレオチドと同様の物理的特性を持つ小分子またはポリマーである非特異的競合物質を使用して、これらの非特異的結合部位を占有することができます。^{[ 13 ]}標的とオリゴヌクレオチドの相対濃度を変化させることで、選択されたアプタマーの特性にも影響を与えることができます。選択されたアプタマーの良好な結合親和性が問題にならない場合は、標的を過剰に用いることで、インキュベーション中に少なくとも一部の配列が結合して保持される確率を高めることができます。しかし、これは高い結合親和性に対する選択圧にはなりません。そのため、オリゴヌクレオチドライブラリーを過剰に用意して、利用可能な特異的結合部位をめぐってユニークな配列間で競合させる必要がある。^{[ 2 ]}

オリゴヌクレオチドライブラリーをターゲットと十分な時間インキュベートした後、固定化されたターゲットから未結合のオリゴヌクレオチドを洗い流します。多くの場合、インキュベーションバッファーを使用して、特異的に結合したオリゴヌクレオチドを保持します。^{[ 3 ]}未結合の配列が洗い流されたら、特異的に結合した配列は、脱イオン水を流す^{[ 3 ]} 、尿素とEDTAを含む変性溶液を使用する^{[ 13 ] [ 14 ]}、または高温と物理的な力を加える^{[ 7 ]}など、オリゴヌクレオチドのアンフォールディングまたは結合コンフォメーションの喪失を促進する変性条件を作成することによって溶出されます。結合した配列が溶出されると、保持されたオリゴヌクレオチドは、RNAまたは修飾塩基選択の場合はDNAに逆転写され^{[ 2 ] [ 3 ] [ 13 ]}、DNA SELEXの場合は増幅のために単純に収集されます。^{[ 15 ]}溶出された配列からのこれらのDNAテンプレートは、 PCRによって増幅され、一本鎖DNA、RNA、または修飾塩基オリゴヌクレオチドに変換され、次の選択ラウンドの初期入力として使用されます。^{[ 2 ] [ 3 ]}

SELEX法において最も重要なステップの1つは、PCR増幅ステップ後に一本鎖DNA（ssDNA）を得ることです。これは次のサイクルの入力となるため、すべてのDNAが一本鎖であり、損失が最小限であることが極めて重要です。比較的簡便なため、最もよく用いられる方法の1つは、増幅ステップでビオチン化逆プライマーを使用し、その後、相補鎖を樹脂に結合させ、苛性ソーダでもう一方の鎖を溶出させる方法です。もう1つの方法は非対称PCRで、増幅ステップを過剰量の順方向プライマーとごく少量の逆方向プライマーで行い、目的の鎖をより多く生成します。この方法の欠点は、生成物を二本鎖DNA（dsDNA）やPCR反応で残ったその他の物質から精製する必要があることです。不要な鎖の酵素分解は、リン酸プローブプライマーを使用してこの鎖を標識することで行うことができます。これは、ラムダエキソヌクレアーゼなどの酵素によって認識されるためです。これらの酵素はリン酸タグ付き鎖を選択的に分解し、相補鎖はそのまま残します。これらの方法はすべて、DNAの約50～70%を回収します。詳細な比較については、これらの方法やその他の方法が実験的に比較されているSvobodováらの論文を参照してください。^{[ 16 ]}古典的なSELEXでは、上記のランダム化一本鎖ライブラリーの生成、ターゲットのインキュベーション、結合配列の溶出と増幅のプロセスが、保持されたプールの大部分がターゲット結合配列になるまで繰り返されます。^{[ 2 ] [ 3 ]}ただし、この手順にはよく使用される修正や追加があり、それについては以下で説明します。

特定の SELEX 手順で選択されたアプタマーの特異性を高めるために、ターゲットのインキュベーションの前または直後に、ネガティブセレクションまたはカウンターセレクションのステップを追加できます。プールからターゲット固定化マトリックス成分に親和性のある配列を除去するために、ライブラリーをターゲット固定化マトリックス成分とインキュベートし、結合していない配列を保持するネガティブセレクションを使用できます。^{[ 14 ] [ 17 ] [ 15 ]}ネガティブセレクションは、オリゴヌクレオチドライブラリーを低分子ターゲットアナログ、望ましくない細胞タイプ、または非ターゲットタンパク質とインキュベートし、結合していない配列を保持することにより、ターゲット様分子または細胞に結合する配列を除去するためにも使用できます。^{[ 13 ] [ 15 ] [ 18 ]}

SELEX反応の進行状況を追跡するには、溶出されたオリゴヌクレオチドの数に相当する標的結合分子の数を、各ラウンドでの溶出後の推定総オリゴヌクレオチド投入量と比較することができます。^{[ 3 ] [ 19 ]}溶出されたオリゴヌクレオチドの数は、260  nm波長の吸光度による溶出濃度推定^{[ 19 ]またはオリゴヌクレオチドの蛍光標識[ 7 ]}によって推定できます。SELEX反応が完了に近づくと、標的に結合するオリゴヌクレオチドライブラリーの割合が100%に近づき、溶出された分子の数は総オリゴヌクレオチド投入量の推定値に近づきますが、より低い数に収束する可能性があります。^{[ 3 ]}

SELEX反応の中には、二次構造形成にプライマー結合領域に依存するプローブを生成するものもある。^{[ 7 ]}短い配列、つまりプライマーの切断が望ましいアプタマーの応用例もある。^{[ 20 ]}元の方法の改良により、RNAライブラリーから定常プライマー領域を省略できるようになった。これらの領域は、ランダム領域のみで形成されると不安定な二次構造を安定化させるため、選択プロセス後に除去するのが難しい場合がある。^{[ 21 ]}