タンパク質の折り畳み

タンパク質の一次構造、すなわち直線状のアミノ酸配列が、その天然の立体構造を決定します。^{[ 11 ]}特定のアミノ酸残基とポリペプチド鎖内での位置が、タンパク質のどの部分が密接に折り畳まれ、三次元の立体構造を形成するかを決定する要因となります。アミノ酸組成は配列ほど重要ではありません。^{[ 12 ]}しかし、折り畳みの本質的な事実は、各タンパク質のアミノ酸配列が、天然の構造と、その状態に至る経路の両方を指定する情報を含んでいるということです。これは、ほぼ同一のアミノ酸配列が常に同様に折り畳まれるという意味ではありません。^{[ 13 ]}立体構造は環境要因によっても異なり、類似のタンパク質でも、存在する場所によって折り畳み方が異なります。

二次構造の形成は、タンパク質が天然構造をとるために行う折りたたみ過程の最初のステップです。二次構造の特徴は、ライナス・ポーリングが最初に特徴づけたように、分子内水素結合によって安定化されるため、急速に折り畳まれるαヘリックスとβシートと呼ばれる構造です。分子内水素結合の形成は、タンパク質の安定性にもう1つの重要な貢献をします。^{[ 14 ]} αヘリックスは、主鎖の水素結合によってらせん状になります（右の図を参照）。^{[ 12 ]} βプリーツシートは、主鎖がそれ自体に折り曲がって水素結合を形成する構造です（左の図に示されています）。水素結合は、ペプチド結合のアミド水素とカルボニル酸素の間にあります。逆平行βシートと平行βシートが存在し、逆平行βシートでは水素結合の安定性が強く、これは平行シートで形成される傾斜した水素結合と比較して、理想的な180度の角度で水素結合を形成するためである。^{[ 12 ]}

αヘリックスとβシートは一般的に両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を持つ。この性質は、タンパク質の三次構造の形成に役立ち、その折り畳みでは、親水性側がタンパク質を取り囲む水性環境に面し、疎水性側がタンパク質の疎水性コアに面する。^{[ 15 ]}二次構造は階層的に三次構造の形成へと移行する。タンパク質の三次構造が形成され、疎水性相互作用によって安定化されると、2つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合の形で共有結合も生じる可能性がある。これらの非共有結合および共有結合の接触は、タンパク質の天然構造において特定のトポロジー配置をとる。タンパク質の三次構造は単一のポリペプチド鎖を含むが、折り畳まれたポリペプチド鎖の追加の相互作用により四次構造が形成される。^{[ 16 ]}

一部のタンパク質では、三次構造から四次構造の形成へと移行することがあり、これは通常、既に折り畳まれたサブユニットの「集合」または「共集合」を伴います。言い換えれば、複数のポリペプチド鎖が相互作用して、完全に機能する四次タンパク質を形成する可能性があります。^{[ 12 ]}

折り畳みは、主に疎水性相互作用、分子内水素結合の形成、ファンデルワールス力によって誘導される自発的なプロセスであり、コンフォメーションエントロピーによって阻害されます。^{[ 17 ]}単離されたタンパク質の折り畳み時間スケールは、そのサイズ、接触順序、および回路トポロジーに依存します。細胞内では、折り畳みプロセスはしばしば共翻訳的に開始されるため、タンパク質のN末端は、タンパク質のC末端部分がまだリボソームによって合成されている間に折り畳まれ始めます。ただし、タンパク質分子は、生合成中または生合成後に自発的に折り畳まれる可能性があります。^{[ 18 ]}これらの高分子は「自ら折り畳まれている」と見なされるかもしれませんが、そのプロセスは、溶媒（水または脂質二重層）^{[ 19 ]} 、塩の濃度、pH、温度、補因子および分子シャペロンの存在の可能性にも依存します。

タンパク質は、可能な曲げ角度または立体構造が制限されているため、折り畳み能力に制約があります。これらのタンパク質折り畳みの許容角度は、ラマチャンドランプロットとして知られる2次元プロットで説明され、許容回転角であるプサイ角とファイ角で示されます。^{[ 20 ]}

疎水性効果

タンパク質の折りたたみが自発的な反応となるためには、細胞内で熱力学的に有利でなければならない。タンパク質の折りたたみは自発的な反応であることが知られているので、負のギブズ自由エネルギー値をとる必要がある。タンパク質の折りたたみにおけるギブズ自由エネルギーは、エンタルピーとエントロピーに直接関係している。^{[ 12 ]}負のΔGが生じ、タンパク質の折りたたみが熱力学的に有利になるためには、エンタルピー、エントロピー、またはその両方の項が有利でなければならない。

水に露出する疎水性側鎖の数を最小限に抑えることは、折り畳み過程の重要な原動力です。^{[ 21 ]}疎水性効果とは、タンパク質の疎水性鎖がタンパク質の中心部（親水性環境から離れた場所）に折り畳まれる現象です。^{[ 12 ]}水性環境では、水分子はタンパク質の疎水性領域または側鎖の周りに集まり、秩序だった水分子の水殻を形成します。^{[ 22 ]}疎水性領域の周りの水分子の秩序は、システムの秩序を高め、したがってエントロピーの負の変化（システムのエントロピーの減少）に寄与します。水分子はこれらの水ケージに固定され、疎水性崩壊、つまり疎水性グループの内側への折り畳みを促進します。疎水性崩壊は、秩序だった水分子を解放する水ケージの破壊を介して、システムにエントロピーを戻します。^{[ 12 ]}球状に折り畳まれたタンパク質のコア内で相互作用する多数の疎水性基は、ファンデルワールス力（特にロンドン分散力）が大量に蓄積されるため、折り畳み後のタンパク質の安定性に大きく寄与する。^{[ 12 ]}疎水性効果は、大きな疎水性領域を含む両親媒性分子を含む水性媒体が存在する場合にのみ、熱力学における駆動力として存在する。 ^{[ 23 ]}水素結合の強さはその環境に依存する。したがって、疎水性コアに包まれた水素結合は、水性環境に露出した水素結合よりも天然状態の安定性に大きく寄与する。^{[ 24 ]}

球状フォールドを持つタンパク質では、疎水性アミノ酸はランダムに分布したりクラスター化したりするのではなく、一次配列に沿って散在する傾向がある。^{[ 25 ] [ 26 ]}しかし、最近新たに生成されたタンパク質は本質的に無秩序な傾向があり、^{[ 27 ] [ 28 ]}一次配列に沿って疎水性アミノ酸がクラスター化するパターンは逆である。^{[ 29 ]}

付き添い人

分子シャペロンは、生体内で他のタンパク質の正しい折り畳みを助けるタンパク質のクラスです。シャペロンはすべての細胞区画に存在し、ポリペプチド鎖と相互作用して、タンパク質の天然の三次元構造の形成を可能にします。ただし、シャペロン自体は、補助しているタンパク質の最終構造には含まれません。^{[ 30 ]}シャペロンは、新生ポリペプチドがリボソームによって合成されているときでも折り畳みを助けることがあります。^{[ 31 ]}分子シャペロンは、折り畳み経路にある不安定なタンパク質の構造に結合して安定化させることで機能しますが、シャペロンは、補助しているタンパク質の正しい天然構造を知るために必要な情報を持っていません。むしろ、シャペロンは、誤った折り畳み構造を防ぐことで機能します。^{[ 31 ]}このように、シャペロンは、天然構造への折り畳み経路に関わる個々のステップの速度を実際に増加させるわけではありません。代わりに、シャペロンは、ポリペプチド鎖の望ましくない凝集を減らすことによって機能し、それによって適切な中間体の探索が遅くなるのを防ぎ、ポリペプチド鎖が正しい立体配座をとるためのより効率的な経路を提供します。^{[ 30 ]}シャペロンは、折り畳み経路の遅い段階を担う化学反応を触媒する折り畳み触媒タンパク質と混同してはいけません。折り畳み触媒の例としては、ジスルフィド結合の形成やペプチド基のシスおよびトランス立体異性体間の相互変換に関与する可能性のあるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼやペプチジルプロリルイソメラーゼがあります。^{[ 31 ]}シャペロンは、タンパク質が「生物学的に関連性のある」状態になるのに十分な効率で適切な配置と立体配座をとるために必要な援助を提供するので、生体内でのタンパク質折り畳みのプロセスにおいて重要であることが示されています。 ^{[ 32 ]}これは、 in vitroで行われたタンパク質折り畳み実験で実証されているように、ポリペプチド鎖は理論的にはシャペロンの助けなしに天然構造に折り畳まれる可能性があることを意味します。^{[ 32 ]}しかし、このプロセスは生物系では効率が悪すぎるか、あるいは遅すぎるため、生体内でのタンパク質フォールディングにはシャペロンが必要である。シャペロンは天然構造の形成を助ける役割に加え、タンパク質の輸送、分解、さらには変性タンパク質の除去など、さまざまな役割に関与していることが示されている。特定の外部変性因子にさらされると、正しい天然構造に折り畳まれる機会が与えられる。^{[ 33 ]}

完全に変性したタンパク質は、三次構造と二次構造の両方を欠いており、いわゆるランダムコイルとして存在します。特定の条件下では、一部のタンパク質は再折り畳みできますが、多くの場合、変性は不可逆です。^{[ 34 ]}細胞は、熱ショックタンパク質（シャペロンの一種）と呼ばれる酵素によって、熱による変性の影響からタンパク質を保護することがあります。これらの酵素は、他のタンパク質の折り畳みと折り畳まれた状態の維持の両方を助けます。 熱ショックタンパク質は、細菌からヒトまで、調査されたすべての種で見つかっており、非常に初期に進化し、重要な機能を持っていることを示唆しています。一部のタンパク質は、シャペロンの助けがなければ細胞内でまったく折り畳まれません。シャペロンは、個々のタンパク質を隔離して、他のタンパク質との相互作用によって折り畳みが妨げられないようにするか、誤って折り畳まれたタンパク質をほどいて、正しい天然構造に再折り畳めるようにします。^{[ 35 ]}この機能は、不溶性の非晶質凝集体への沈殿のリスクを防ぐために重要です。タンパク質の変性や天然状態の破壊に関わる外部要因には、温度、外部場（電場、磁場）^{[ 36 ]} 、分子の混雑^{[ 37 ]}、さらには空間の制限（閉じ込め）などがあり、これらはタンパク質の折り畳みに大きな影響を与える可能性があります。^{[ 38 ]}高濃度の溶質、極端なpH、機械力、化学変性剤の存在もタンパク質の変性に寄与する可能性があります。これらの個々の要因はまとめてストレスとして分類されます。シャペロンは細胞ストレス時に濃度が上昇し、新たに生成されるタンパク質や変性またはミスフォールドしたタンパク質の適切な折り畳みを助けることが示されています。^{[ 30 ]}

特定の条件下では、タンパク質は生化学的に機能する形態に折り畳まれません。細胞が生存する範囲を超える温度または下回る温度では、熱的に不安定なタンパク質が展開または変性します（これが、沸騰すると卵白が不透明になる理由です）。しかし、タンパク質の熱安定性は一定ではありません。たとえば、 122 °Cという高温で生育する超好熱性古細菌が見つかっています^{[ 39 ]。}もちろん、そのためには、その温度以上で、生命維持に必要なタンパク質とタンパク質集合体のすべてが安定している必要があります。 

大腸菌はバクテリオファージT4の宿主であり、ファージがコードするgp31タンパク質（P17313 ）は、大腸菌のシャペロンタンパク質GroESと構造的にも機能的にも相同であり、感染時のバクテリオファージT4ウイルス粒子の組み立てにおいてGroESの代わりを務めることができるようです。^{[ 40 ]} GroESと同様に、gp31はGroELシャペロニンと安定な複合体を形成し、これはバクテリオファージT4の主要カプシドタンパク質gp23の生体内での折り畳みと組み立てに絶対に必要です。^{[ 40 ]}

一部のタンパク質は複数の天然構造を持ち、外部要因に基づいて折り畳み構造を変化させます。例えば、KaiBタンパク質は一日を通して折り畳み構造を変化させ、シアノバクテリアの時計として機能します。PDB（タンパク質データバンク）に登録されているタンパク質の約0.5 ～ 4%が折り畳み構造を変化させると推定されています。^{[ 41 ]}

X線結晶構造解析は、折り畳まれたタンパク質の三次元構造を解読するための最も効率的で重要な方法の1つです。^{[ 47 ]} X線結晶構造解析を行うには、調査対象のタンパク質が結晶格子内に存在する必要があります。タンパク質を結晶格子内に配置するには、結晶化に適した溶媒を用意し、溶液中で過飽和レベルの純粋なタンパク質を得て、溶液中で結晶を沈殿させる必要があります。^{[ 48 ]}タンパク質が結晶化すると、X線ビームを結晶格子を通して集中させることができ、ビームは回折するか、さまざまな方向に外向きに発射されます。これらの出射ビームは、内部に閉じ込められたタンパク質の特定の三次元構造と相関しています。X線は、タンパク質結晶格子内の個々の原子を取り囲む電子雲と特異的に相互作用し、識別可能な回折パターンを生成します。^{[ 15 ]}電子密度雲と X 線の振幅を関連付けることによってのみこのパターンを読み取ることができ、この方法を複雑にする位相または位相角の仮定につながります。^{[ 49 ]}フーリエ変換として知られる数学的基礎によって確立された関係がなければ、「位相問題」により回折パターンの予測が非常に困難になります。^{[ 15 ]}多重同形置換などの新しい方法は、重金属イオンの存在を利用して X 線をより予測可能な方法で回折させ、関係する変数の数を減らし、位相問題を解決します。^{[ 47 ]}

蛍光分光法は、タンパク質の折り畳み状態を研究するための非常に高感度な方法です。フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）の3つのアミノ酸は固有の蛍光特性を持っていますが、良好な蛍光シグナルが得られるほど量子収率が高いため、実験的に使用されるのはTyrとTrpのみです。TrpとTyrはどちらも280  nmの波長で励起されますが、295 nmの波長で励起されるのはTrpのみです 。芳香族性のため、TrpとTyr残基は、タンパク質の疎水性コア、2つのタンパク質ドメイン間の界面、またはオリゴマータンパク質のサブユニット間の界面に完全にまたは部分的に埋もれていることがよくあります。このような非極性環境では、量子収率が高く、したがって蛍光強度も高くなります。タンパク質の三次構造または四次構造が破壊されると、これらの側鎖は溶媒の親水性環境にさらされるようになり、量子収率が低下し、蛍光強度が低下します。トリプトファン残基の場合、最大蛍光発光波長は周囲の環境にも依存する。

蛍光分光法は、変性剤の値の関数として蛍光発光強度または最大発光波長の変化を測定することにより、タンパク質の平衡アンフォールディングを特徴付けるために使用できます。 ^{[ 50 ] [ 51 ]}変性剤は、化学分子（尿素、塩酸グアニジン）、温度、pH、圧力などです。異なるが離散的なタンパク質状態、すなわち天然状態、中間状態、アンフォールディング状態間の平衡は変性剤の値に依存します。したがって、それらの平衡混合物の全体的な蛍光信号もこの値に依存します。このようにして、全体的なタンパク質信号と変性剤の値の関係を示すプロファイルが得られます。平衡アンフォールディングのプロファイルにより、アンフォールディングの中間体を検出および識別することができます。^{[ 52 ] [ 53 ]}ヒューグ・ベドゥエルは、このようなプロファイルから、ホモマーまたはヘテロマーのタンパク質（三量体、場合によっては四量体まで）の展開平衡を特徴付ける熱力学的パラメータを取得するための一般式を開発しました。^{[ 50 ]}蛍光分光法は、ストップドフローなどの高速混合装置と組み合わせて、タンパク質の折りたたみ速度を測定し、^{[ 54 ]}シェブロンプロットを生成し、ファイ値分析を導出することができます。

円偏光二色性は、タンパク質の折り畳みを研究するための最も一般的で基本的なツールの 1 つです。円偏光二色性分光法は、円偏光の吸収を測定します。タンパク質では、 α ヘリックスやβ シートなどの構造はキラルであり、このような光を吸収します。この光の吸収は、タンパク質集合体の折り畳みの度合いのマーカーとして機能します。この技術は、変性剤濃度または温度の関数としてこの吸収の変化を測定することにより、タンパク質の平衡アンフォールディングを測定するために使用されてきました。変性剤融解は、アンフォールディングの自由エネルギーとタンパク質の m 値、つまり変性剤依存性を測定します。温度融解は、タンパク質の変性温度(Tm) を測定します。 ^{[ 50 ]}蛍光分光法と同様に、円偏光二色性分光法は、ストップドフローなどの高速混合装置と組み合わせて、タンパク質の折り畳み速度論を測定し、シェブロン プロットを生成することができます。

近年開発されたタンパク質の振動円二色性（VCD）技術は、フーリエ変換（FT）装置を用いることで、非常に大きなタンパク質分子であっても、溶液中のタンパク質の立体構造を決定する強力な手段を提供する。このようなタンパク質のVCD研究は、タンパク質結晶のX線回折データ、重水（D₂O）中のタンパク質溶液のFT-IRデータ_、または量子計算と組み合わせることができる。

タンパク質核磁気共鳴（NMR）は、濃縮タンパク質のサンプルに磁場を誘起することで、タンパク質の構造データを収集することができます。NMRでは、化学環境に応じて、特定の原子核が特定の無線周波数を吸収します。^{[ 55 ] [ 56 ]}タンパク質の構造変化はナノ秒からミリ秒の時間スケールで起こるため、NMRはピコ秒から秒の時間スケールでの中間構造の研究に特に適しています。^{[ 57 ]}タンパク質の構造と非折り畳みタンパク質構造変化を研究するための主な手法には、COSY、TOCSY、  HSQC、時間緩和（T1およびT2）、およびNOEなどがあります。^{[ 55 ]} NOEは、空間的に近接した水素間で磁化移動が観測されるため、特に有用です。^{[ 55 ]}さまざまなNMR実験は、さまざまなタンパク質構造変化に適したさまざまな時間スケール感度を持っています。NOEは結合振動や側鎖回転を検出できますが、タンパク質の折り畳みはより大きな時間スケールで起こるため、NOEは感度が高すぎて検出できません。^{[ 57 ]}

タンパク質の折り畳みは約 50 ～ 3000 秒で起こるため、^CPMG緩和分散と化学交換飽和移動は、折り畳みの NMR 分析の主要な手法となっています。^{[ 56 ]}さらに、両方の手法は、タンパク質の折り畳みランドスケープにおける励起中間状態を明らかにするためにも使用されます。^{[ 58 ]}このため、CPMG 緩和分散はスピンエコー現象を利用します。この手法では、ターゲット核に 90 パルスを照射し、続いて 1 つ以上の 180 パルスを照射します。^{[ 59 ]}核が再収束すると、広い分布はターゲット核が中間励起状態に関与していることを示します。緩和分散プロットを調べることで、データは励起状態と基底状態の間の熱力学と速度論に関する情報を収集します。^{[ 59 ] [ 58 ]}飽和移動は、励起状態が摂動を受けるにつれて基底状態からの信号の変化を測定します。これは、弱い無線周波数照射を使用して特定の原子核の励起状態を飽和させ、その飽和を基底状態に伝達します。^{[ 56 ]}この信号は、基底状態の磁化（および信号）を減少させることによって増幅されます。^{[ 56 ] [ 58 ]}

NMRの主な限界は、25 kDaより大きいタンパク質では分解能が低下し、X線結晶構造解析ほど詳細ではないことである。^{[ 56 ]}さらに、タンパク質NMR分析は非常に難しく、同じNMRスペクトルから複数の解を提案する可能性がある。^{[ 55 ]}

筋萎縮性側索硬化症に関与するタンパク質SOD1の折り畳みに焦点を当てた研究では、緩和分散と飽和移動を用いて励起中間体が研究された。^{[ 60 ]} SOD1はこれまで、タンパク質凝集に関与すると考えられる多くの疾患原因変異体と関連付けられてきたが、そのメカニズムはまだ不明であった。緩和分散と飽和移動実験を用いることで、SOD1変異体におけるミスフォールディングの多くの励起中間状態が明らかになった。^{[ 60 ]}

二重偏光干渉法は、分子層の光学的特性を測定する表面ベースの技術です。タンパク質の折り畳みを特徴付けるために使用する場合、タンパク質の単分子層の全体的なサイズとその密度をサブオングストロームの分解能でリアルタイムに決定することにより、コンフォメーションを測定します^{[ 61 ]。}ただし、タンパク質の折り畳みの速度論のリアルタイム測定は、約10 Hzよりも遅いプロセスに限定されます。円偏光二色性 と同様に、折り畳みの刺激は変性剤または温度です。

タンパク質フォールディングの研究は、近年、高速かつ時間分解型の技術の開発によって大きく進歩した。実験者は、折り畳まれていないタンパク質のサンプルを迅速に折り畳ませ、その結果生じる動態を観察する。現在用いられている高速技術には、溶液の超高速混合、光化学的手法、レーザー温度ジャンプ分光法などがある。これらの技術の開発に貢献した多くの科学者の中には、ハインリッヒ・ローダー、テリー・オアス、ハリー・グレイ、マーティン・グルーベル、ブライアン・ダイアー、ウィリアム・イートン、シーナ・ラドフォード、クリス・ドブソン、アラン・ファーシュト、ベングト・ネルティング、ラース・コナーマンなどがいる。

プロテオリシスは、幅広い溶液条件下で展開した画分を調べるために日常的に使用されています（例：高速並列プロテオリシス（FASTpp））。^{[ 62 ] [ 63 ]}

光ピンセットやAFMなどの単一分子技術は、単離されたタンパク質やシャペロンを持つタンパク質のタンパク質折り畳み機構を理解するために使用されてきた。^{[ 64 ]}光ピンセットは、単一のタンパク質分子をC末端とN末端から引き伸ばし、折り畳みを解除して、その後の再折り畳みを研究するために使用されてきた。^{[ 65 ]}この技術により、単一分子レベルで折り畳み速度を測定できる。たとえば、光ピンセットは最近、血液凝固に関与するタンパク質の折り畳みと展開の研究に応用されている。フォン・ヴィルブランド因子（vWF）は、血液凝固プロセスにおいて重要な役割を果たすタンパク質である。単一分子光ピンセット測定により、カルシウム結合vWFが血液中でせん断力センサーとして機能することが発見された。せん断力はvWFのA2ドメインの展開を引き起こし、その再折り畳み速度はカルシウムの存在下で劇的に増加する。^{[ 66 ]}また、単純なsrc SH3ドメインは、力の下で複数のアンフォールディング経路にアクセスすることも示されている。^{[ 67 ]}

ビオチンペインティングは、（折り畳まれた）タンパク質の条件特異的な細胞スナップショットを可能にする。ビオチン「ペインティング」は、予測される内在性無秩序タンパク質に対する偏りを示す。^{[ 68 ]}

1969年、サイラス・レヴィンサルは、折り畳まれていないポリペプチド鎖の自由度が非常に大きいため、分子には天文学的な数の可能な立体配座が存在すると指摘した。彼の論文の1つでは、^3,300または^{10,143という推定値が提示された。 [ 70 ]}レヴィンサルのパラドックスは、タンパク質をすべての可能な立体配座を順次サンプリングして折り畳むと、たとえ立体配座を高速でサンプリングしても（ナノ秒またはピコ秒スケールで）、折り畳むのに天文学的な時間がかかるという観察に基づく思考実験である。^{[ 71 ]}タンパク質はこれよりもはるかに速く折り畳まれるという観察に基づき、レヴィンサルは、ランダムな立体配座探索は起こらず、したがってタンパク質は一連の準安定な中間状態を経て折り畳まれるに違いないと提唱した。

タンパク質の折り畳み過程における配置空間は、エネルギーランドスケープとして視覚化できる。ジョセフ・ブリンゲルソンとピーター・ウォリンズによれば、タンパク質は最小フラストレーションの原理に従っており、これは、自然に進化してきたタンパク質が折り畳みエネルギーランドスケープを最適化しており、^{[ 72 ]}自然がタンパク質の折り畳み状態が十分に安定するようにアミノ酸配列を選択してきたことを意味する。さらに、折り畳み状態の獲得は十分に速いプロセスでなければならなかった。自然はタンパク質のフラストレーションのレベルを下げてきたが、タンパク質のエネルギーランドスケープに局所的最小値が存在することからわかるように、ある程度のフラストレーションは今日まで残っている。

これらの進化的に選択された配列の結果として、タンパク質は一般的に、天然状態に向かって大きく方向付けられたグローバルな「漏斗状のエネルギーランドスケープ」（ホセ・オヌチッチが作った用語）^{[ 73 ]}を持つと考えられています。この「折りたたみ漏斗」ランドスケープにより、タンパク質は単一のメカニズムに限定されることなく、多数の経路と中間体のいずれかを介して天然状態に折りたたむことができます。この理論は、モデルタンパク質の計算シミュレーションと実験的研究の両方によって裏付けられており^{[ 72 ]} 、タンパク質構造予測と設計の方法を改善するために使用されています。^{[ 72 ]}平準化自由エネルギーランドスケープによるタンパク質折りたたみの説明は、熱力学の第2法則とも一致しています。^{[ 74 ]}物理的には、ランドスケープを、地理的な地形のように、単に最大値、鞍点、最小値、漏斗を備えた視覚化可能なポテンシャルまたは全エネルギー面として考えることは、少し誤解を招くかもしれません。関連する記述は、実際には多様体がさまざまなより複雑な位相形式をとる可能性のある高次元位相空間である。^{[ 75 ]}

展開したポリペプチド鎖は、最も多くの展開バリエーションをとることができ、最も高いエネルギー状態にある漏斗の上部から始まります。このようなエネルギーランドスケープは、多数の初期可能性が存在するが、可能なネイティブ状態は1つだけであることを示していますが、可能な多数の折りたたみ経路は明らかにしていません。まったく同じタンパク質の異なる分子は、同じネイティブ構造に到達する限り、異なる低エネルギー中間体を求めて、わずかに異なる折りたたみ経路をたどることができる可能性があります。^{[ 76 ]}異なる経路は、各経路の熱力学的有利性に応じて、異なる頻度で利用される可能性があります。これは、ある経路が別の経路よりも熱力学的に有利であることが判明した場合、ネイティブ構造の追求において、その経路がより頻繁に使用される可能性が高いことを意味します。^{[ 76 ]}タンパク質が折りたたみ、さまざまなコンフォメーションをとると、常に以前よりも熱力学的に有利な構造を求め、エネルギー漏斗を通り続けます。二次構造の形成はタンパク質内の安定性の向上を示す強い指標であり、ポリペプチド主鎖がとる二次構造の組み合わせのうち、エネルギーが最も低いものだけがタンパク質の天然状態に存在する。^{[ 76 ]}ポリペプチドが折り畳まれ始めると最初に形成される構造の中には、αヘリックスとβターンがあり、αヘリックスはわずか100ナノ秒で、βターンは1マイクロ秒で形成される。^{[ 30 ]}

エネルギーファネルランドスケープには、特定のタンパク質の遷移状態が見つかる鞍点が存在する。 ^{[ 30 ]}エネルギーファネル図における遷移状態は、タンパク質が最終的に天然構造をとるためには、そのタンパク質のすべての分子がとらなければならないコンフォメーションである。遷移状態を経由せずに天然構造をとるタンパク質は存在しない。^{[ 30 ]}遷移状態は、単なる中間段階ではなく、天然状態の変異体または未成熟形態とみなすことができる。^{[ 77 ]}遷移状態の折り畳みは律速段階であることが示されており、天然の折り畳みよりも高いエネルギー状態に存在するにもかかわらず、天然構造に非常によく似ている。遷移状態内には、タンパク質が折り畳むことができる核が存在し、これは「核形成凝縮」と呼ばれるプロセスによって形成され、構造が核に向かって崩壊し始める。^{[ 77 ]}

計算によるタンパク質構造予測のためのde novoまたはab initio手法は、タンパク質折り畳みのさまざまな側面をシミュレートするために使用できます。タンパク質折り畳みの最初のコンピュータシミュレーションは、1975年にLevittとWarshelによって実行されました（Nature 1975）。折り畳み^{[ 78 ]}パスが生成され、折り畳まれた構造に近い構造に崩壊し、基本的にLeventhalのパラドックスの「解決」を提供しました。このシミュレーションには、折り畳みプロセスの動的側面のいくつかを調査するノーマルモード処理も含まれていました。分子動力学（MD）は、 in silicoでのタンパク質折り畳みとダイナミクスのシミュレーションに使用されました。 ^{[ 79 ]}最初の平衡折り畳みシミュレーションは、暗黙的溶媒モデルとアンブレラサンプリングを使用して行われました。 ^{[ 80 ]}計算コストのため、明示的な水を使用したab initio MD折り畳みシミュレーションは、ペプチドと小さなタンパク質に限定されています。 ^{[ 81 ] [ 82 ]}より大きなタンパク質の MD シミュレーションは、実験構造のダイナミクスまたは高温での展開に限定されています。より大きなタンパク質 (> 150 残基) の折り畳みなどの長時間の折り畳みプロセス (約 1 ミリ秒以上) は、粗視化モデルを使用してアクセスできます。 ^{[ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]}

Rosetta@home ^{[ 86 ]} 、Folding@home ^{[ 87 ]}、Foldit [ ^{88 ]}など、いくつかの大規模な計算プロジェクトは^{タンパク質}の折り畳みを対象としています。

DE Shaw ResearchがカスタムASICと相互接続を中心に設計・構築した超並列スーパーコンピュータAnton上で、長時間の連続軌道シミュレーションが実行されてきました。2011 年時点で Anton を使用して実行されたシミュレーションの最長の公開結果は、355 K での NTL9 の 2.936 ミリ秒のシミュレーションでした。^{[ 89 ]}このようなシミュレーションは現在、小さなタンパク質 (150 アミノ酸残基未満) を平衡状態で展開および再折り畳みし、変異が折り畳み速度と安定性にどのように影響するかを予測することができます。^{[ 90 ]}

2020年、DeepMindが開発した人工知能（AI）タンパク質構造予測プログラムであるAlphaFoldを使用した研究者チームが、長年続く構造予測コンテストCASPで1位を獲得しました。 ^{[ 91 ]}このチームは、他のどのグループよりもはるかに高い精度を達成しました。^{[ 92 ]} CASPのグローバル距離テスト（GDT）では、タンパク質の約3分の2で90%以上のスコアを獲得しました。GDTは、計算プログラムによって予測された構造と、実験室で実験的に決定された経験的構造との類似性の度合いを測定するテストです。GDTの計算に使用される距離カットオフ内では、100のスコアは完全な一致とみなされます。^{[ 93 ]}

CASP での AlphaFold のタンパク質構造予測結果は「革新的」かつ「驚異的」と評された。^{[ 94 ] [ 95 ]}一部の研究者は、予測の 3 分の 1 については精度が十分ではなく、タンパク質折り畳み問題が解決されたとみなされるには、タンパク質折り畳みの物理的メカニズムが明らかになっていないと指摘した。^{[ 96 ]}それにもかかわらず、これは計算生物学における重要な成果であり^{[ 93 ]}、数十年来の生物学の大きな課題であるタンパク質の構造予測に向けた大きな進歩であると考えられている。^{[ 94 ]}