カイB

概日リズム（生物学的プロセスにおける内因性で同調可能な振動で、周期はおおよそ24時間周期に対応する）は、かつては真核生物に特有の性質だと考えられていた。原核生物は、持続的で温度補償された時間計測を維持するための細胞の複雑さを欠いていると考えられていた。さらに、広く支持されている「概日-超日周期の法則」では、細胞機能は24時間周期で1回しか分裂しない細胞でのみ概日振動子と連動できると規定されていた。1日に複数回細胞分裂を行うことが多い原核生物は、この条件を満たしていなかった。^{[ 1 ]}

時が経つにつれ、この主張に異議を唱え、細菌の概日リズムの存在を支持する証拠が増え始めた。例えば、シアノバクテリアで観察された光合成と窒素固定の明確な時間的分離は、概日制御のメカニズムの存在を示唆していた。^{[ 2 ]}そしてついに、1986年にTan-Chi Huangらは、シアノバクテリアSynechococcusで窒素固定の頑健な24時間リズムを発見し特徴づけ、原核生物種における概日リズム性を実証した。^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}これらの発見を受けて、時間生物学者はシアノバクテリアの時計の動作を制御する分子メカニズムの特定に着手した。

近藤隆夫、石浦正博、スーザン・ゴールデン、カール・ジョンソンらは、シアノバクテリアのSynechococcusに見られるこの時計遺伝子の活性をモニターするために、遺伝子発現のレポーターである細菌ルシフェラーゼをpsbAI遺伝子に用いた。44時間周期の時計変異体C44aを、プラスミドベクター内の野生型（WT）ゲノムDNAライブラリーで形質転換することにより、25時間の正常周期を持つ「レスキュークローン」をテストすることができた。このレスキュークローンのDNAライブラリーを元の部位のプラスミドに挿入すると、C44aは完全にレスキューされたことがわかった。レスキューに関与するプラスミド断片をシーケンスしたところ、単一の遺伝子クラスターkaiABCが周期的な性質を持つことがわかった。kaiABCは、 kaiA、kaiB、kaiCの3つの個別の遺伝子から構成されている。 50 を超える時計変異体におけるレスキューパターンの調査により、短い周期、長い周期、または不整脈のいずれかが示され、すべての変異体で野生型表現型への回復が明らかになった。さらにシーケンス解析を行った結果、合計 19 個のkaiABC特異的変異体が明らかになり、そのうち 14 個はkaiCに、3 個はkaiAに、2 個はkaiBに変異があった。^{[ 6 ]}変異体の表現型はすべて、前述の遺伝子のいずれかの単一のアミノ酸置換によって引き起こされていることから、Kai タンパク質がSynechococcus の概日時計において重要な役割を果たしていることがわかった。

当初、概日リズムの形成には転写-翻訳フィードバックループが必要であると考えられていたため、kaiABCもこの機能を持つと考えられていた。しかし、後に転写阻害剤または翻訳阻害剤を用いてkaiBC mRNAの蓄積を阻害しても、kaiCリン酸化の概日周期は妨げられないことが発見された。したがって、シアノバクテリアの時計リズムは転写と翻訳の両方から独立しているということになる。^{[ 7 ]}さらに、 kaiABC遺伝子クラスターの調節において重要なKaiCリン酸化の自己持続振動を検証する実験が行われた。KaiCをKaiAおよびKaiB、ならびにATPとともに培養することで、KaiABC時計の温度補償の側面が証明された。さらに、kaiC in vivo変異体で見られるような概日周期は、 in vitro株でも観察された。^{[ 8 ]}

kaiA、kaiB、kaiC遺伝子によってコードされるシアノバクテリアの中核的な概日振動子は、遺伝子発現の全体的なパターンを制御し、光合成や細胞分裂などの必須の細胞プロセスを統制する。KaiCのリン酸化と脱リン酸化の周期的かつ連続的なリズムは、生体内および試験管内における振動子の時間計測機構を構成する。

KaiCは環状のホモヘキサマーとして構成されている。各モノマー成分は、CIドメイン、CIIドメイン、Bループ結合ドメイン、およびC末端から突き出たAループと呼ばれるテールという4つの必須構造モチーフを含んでいる。CIドメインとCIIドメインはKaiCヘキサマー内で整列しているため、これらはまとめてCIリングとCIIリングと呼ばれる。^{[ 14 ]} KaiCは、自己キナーゼ活性と自己リン酸化活性の両方を内在的に持ち、それぞれKaiAとKaiBの結合によって調節される。特に、CIIリングのSer431およびThr432残基のリン酸化と脱リン酸化は、Kai振動子の概日リズムを駆動する。^{[ 15 ]}

主観的な一日の開始時、KaiC六量体のSer431およびThr432残基はリン酸化されておらず、構成モノマーのAループドメインが露出している。KaiAはKaiCのAループドメインに結合し、自己リン酸化活性を促進する。タンパク質のリン酸化は順序立てて連続的に起こり、まずThr432がリン酸化され、次にSer431がリン酸化される。Ser431残基のリン酸化は、KaiC六量体の大きな構造変化を引き起こす。タンパク質複合体のCI環とCII環がより密に積み重なり、これまで隠されていたBループが露出する。BループはKaiBをリクルートし、KaiBはKaiAとKaiCに同時に結合する。KaiBの結合はKaiAをAループから引き離し、その結果、KaiCの自己ホスファターゼ活性を促進すると同時に、自己リン酸化活性を阻害する。 KaiCの脱リン酸化は主観的な夜間に起こり、リン酸化の逆の順序で進行します。Thr432はSer431よりも先に脱リン酸化されます。^{[ 10 ]}

最終的に、KaiAとKaiBの結合によって制御されるKaiCリン酸化の概日リズムは、変化する環境条件に同調するための入力経路と、転写イベントを媒介するための出力経路の両方と相互作用できる翻訳後振動子を作り出す。

Kaiオシレーターはリン酸化における内因性リズムを生成する能力を持つものの、遺伝子発現に直接影響を与えることはない。Kaiタンパク質はいずれもDNA結合ドメインを持たない。その代わりに、ヒスチジンキナーゼであるSasAと転写因子であるRpaAからなる二成分系が、KaiCのリン酸化の変化を転写イベントに結びつけている。

SasAは、Ser431残基のリン酸化によって露出したKaiC分子のBループに結合することができる。この相互作用により、SasAの自己リン酸化とそれに続くRpaAへのリン酸転移が促進される。リン酸化されたRpaAは、夕暮れピーク（クラス1）遺伝子の発現を活性化し、夜明けピーク（クラス2）遺伝子の発現を抑制する。逆に、リン酸化されていないRpaAは、クラス1遺伝子の発現を抑制する。その結果、Kai振動子とそれに伴うSasA活性によって駆動される転写因子のリズミカルなリン酸化により、遺伝子発現にリズミカルなパターンが生じる。^{[ 16 ]}

KaiBはSasA-RpaA経路の主要な調節因子として機能し、概日リズムの生成に寄与し、SasAおよびKaiCとの相互作用を促進する構造的適応を示します。シアノバクテリアで発現するKaiBの大部分は、KaiCと相互作用できない不活性なホモ四量体として存在します。KaiB四量体は、タンパク質の単量体形態と平衡状態にあります。しかし、単量体のKaiBは、KaiCと結合するために三次構造の根本的な変化を受け、いわゆる基底状態コンフォメーション（gs-KaiB）から、KaiCのBループに結合できるフォールドスイッチコンフォメーション（fs-KaiB）にシフトする必要があります。現在までに、KaiBは可逆的なフォールドスイッチが可能なタンパク質のクラスである、唯一知られているメタモルフィッククロックタンパク質です。^{[ 10 ]}

Fs-KaiBはチオレドキシン様フォールドを持ち、SasAのN末端とよく似ており、キナーゼのKaiCへの結合を競合的に置換する。しかし、gs-KaiBからfs-KaiBへの構造変化はゆっくりと起こるため、Bループが最初に露出する正午から夕暮れまで、SasAがKaiCに結合し、下流のRpaAが活性化される。^{[ 17 ]}その結果、リン酸化RpaAは日が進むにつれて蓄積し、夕暮れ近くにピークに達し、クラス1遺伝子の発現増加のタイミングを適切に調整する。さらに、KaiB結合のこの時間遅延は、KaiCの自己ホスファターゼ活性の開始を遅らせ、シアノバクテリア振動体の概日周期に寄与する。

KaiABC発振器のリズム性は試験管内で再構成できるが、体内時計は生体内ではさまざまな追加レベルの制御を受ける。たとえば、リズム性を維持するためには時計構成要素の化学量論比を維持しなければならない。^{[ 18 ]} kaiBとkaiCは、転写産物とタンパク質レベルが一日を通して大きく変動するが、単一のプロモーターの制御下にあるオペロンを構成し、ポリシストロン性mRNAとして転写される。対照的に、独立したプロモーターの制御下にあるKaiAのタンパク質レベルは、24時間周期にわたってほぼ一定である。^{[ 10 ] [ 19 ]}

さらに、Kai発振器の位相は環境変化に応じてシフトすることができます。しかし、真核生物で特徴付けられている位相シフト機構とは異なり、光色素はシアノバクテリアの時計の同調には関与していないようです。代わりに、特定された入力機構は、シアノバクテリアによって行われる光合成反応を追跡する生化学的変化に依存しており、これらの反応は周囲の光強度に比例して速度が増加します。たとえば、CikAとLdpAは細胞内環境の酸化還元状態を感知し、変化をKai発振器に伝達します。^{[ 20 ]}さらに、KaiAとKaiCは光合成の代謝産物、特にキノンとATPを直接検出し、それに応じて発振器の位相を調整しているようです。^{[ 20 ] [ 21 ]}現在までに、KaiBはシアノバクテリアの時計を同調できる入力経路に関与していないことが示されています。