円二色性

円二色性（CD）は、円偏光を伴う二色性、すなわち左手系と右手系の光の異なる吸収である。^{[1] [2]}左円偏光（LHC）と右円偏光（RHC）の光は、光子の2つの可能なスピン角運動量状態を表すため、円二色性はスピン角運動量の二色性とも呼ばれる。 ^[3]この現象は、19世紀前半にジャン＝バティスト・ビオ、オーギュスタン・フレネル、エメ・コットン によって発見された。 ^[4]円二色性と円複屈折は光学活性の現れである。これは、光学活性なキラル分子の吸収帯に現れる。CD分光法は、さまざまな分野で幅広い用途に使用されている。最も顕著な例としては、UV CDはタンパク質の二次構造を調べるために使用される。^{[5] UV/Vis CDは}電荷移動遷移を調べるために使用される。^[6]近赤外CDは金属のd → d遷移を調べることで幾何学的構造と電子構造を調べるために使用されます。 ^[2]振動円二色性は赤外線エネルギー領域の光を使用し、小さな有機分子、最近ではタンパク質やDNAの構造研究に使用されています。^[5]

電磁波は、互いに垂直に、また伝播方向に対して垂直に振動する電場と磁場から成り、 ^[7]横波。直線偏光は電場ベクトルが 1 つの平面でのみ振動するときに発生するのに対し、円偏光は電場ベクトルの方向がベクトルの大きさを一定に保ちながら伝播方向の周りを回転するときに発生する。空間内の 1 つの点では、円偏光ベクトルは波の周波数の 1 周期にわたって円を描くため、この名前が付けられています。以下の 2 つの図は、直線偏光と円偏光の電場ベクトルをある瞬間、さまざまな位置で示しています。円偏光の電気ベクトルのプロットは、伝播方向に沿ってらせんを形成します。観測者に向かって伝播する左円偏光 (LCP) の場合、電気ベクトルは反時計回りに回転します。^[2]右円偏光 (RCP) の場合、電気ベクトルは時計回りに回転します。 ${\displaystyle {\boldsymbol {E}}}$${\displaystyle {\boldsymbol {B}}}$${\displaystyle {\boldsymbol {k}}}$

円偏光が吸収光学活性媒体を通過すると、右偏光と左偏光の速度 ( ) だけでなく、波長( ) と吸収される程度 ( ) も異なります。円二色性は、その差です。^[5]光線の電場は、分子と相互作用するときに電荷の直線的な変位を引き起こし (電気双極子)、その磁場は電荷の循環を引き起こします (磁気双極子)。これら 2 つの運動が組み合わさって、電子のらせん運動への励起を引き起こします。これには、並進と回転、およびそれらに関連する演算子が含まれます。サンプルの回転強度と の間の実験的に決定された関係は、次のように与えられます。 ${\displaystyle c_{\mathrm {L} }\neq c_{\mathrm {R} }}$${\displaystyle \lambda _{\mathrm {L} }\neq \lambda _{\mathrm {R} }}$${\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {L} }\neq \varepsilon _{\mathrm {R} }}$${\displaystyle \Delta \varepsilon \equiv \varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }}$${\displaystyle R}$${\displaystyle \Delta \varepsilon }$

${\displaystyle R_{\mathrm {exp} }={\frac {3hc10^{3}\ln(10)}{32\pi ^{3}N_{\mathrm {A} }}}\int {\frac {\Delta \varepsilon }{\nu }}\mathrm {d} {\nu }}$

回転強度も理論的に決定されており、

${\displaystyle R_{\mathrm {theo} }={\frac {1}{2mc}}\mathrm {Im} \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.双極子)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau \bullet \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau }$

これら 2 つの方程式から、 をゼロ以外にするためには、電気双極子モーメント演算子 (および) を同じ既約表現として変換する必要があることがわかります。および は、これが発生する唯一の点群であり、キラル分子 CD のみがアクティブになります。 ${\displaystyle \Delta \varepsilon }$${\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }}$${\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }}$${\displaystyle \mathrm {C} _{n}}$${\displaystyle \mathrm {D} _{n}}$

簡単に言えば、円偏光自体が「キラル」であるため、キラル分子との相互作用が異なります。つまり、2 種類の円偏光は、異なる程度に吸収されます。CD 実験では、選択した波長の等量の左円偏光と右円偏光が交互に (キラル) サンプルに照射されます。2 つの偏光のうちの 1 つがもう 1 つよりも多く吸収され、この波長依存の吸収の差が測定され、サンプルの CD スペクトルが生成されます。分子との相互作用により、光の電場ベクトルはサンプルを通過した後、楕円形の経路を描きます。

分子のキラリティーは構造的というよりは立体配座的なものになり得ることが重要です。つまり、たとえばらせん状の二次構造を持つタンパク質分子は、立体配座の変化に応じて変化する CD を持つことができます。

定義上、

${\displaystyle \Delta A=A_{\mathrm {L} }-A_{\mathrm {R} }\,}$

ここで、（デルタ吸光度）は、左円偏光（LCP）と右円偏光（RCP）の光の吸光度の差です（通常、これが測定されます）。 は波長の関数であるため、測定が意味のあるものになるためには、測定が行われた波長がわかっていなければなりません。 ${\displaystyle \デルタA}$${\displaystyle \デルタA}$

ビールの法則を適用すると、次のように表現することもできます。

${\displaystyle \Delta A=(\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} })Cl\,}$

どこ

${\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {L} }}$およびLCP光とRCP光のモル吸光係数である。${\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {R} }}$

${\displaystyle C}$はモル濃度であり、

${\displaystyle l}$パスの長さをセンチメートル (cm) で表したものです。

それから

${\displaystyle \Delta \varepsilon =\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }\,}$

はモル円二色性です。この固有の特性は、通常、物質の円二色性によって意味されます。 は波長の関数であるため、モル円二色性の値 ( ) は、それが有効な波長を指定する必要があります。 ${\displaystyle \Delta \varepsilon }$${\displaystyle \Delta \varepsilon }$

以下に説明するように、円二色性 (CD) の多くの実際の用途では、測定された CD は単に分子の固有の特性ではなく、分子の立体配座に依存します。このような場合、CD は温度、濃度、および溶媒を含む化学環境の関数になることもあります。この場合、報告された CD 値が意味を持つためには、これらの他の関連要因も指定する必要があります。

2回回転対称性を欠く秩序構造では、円偏光波の差動透過^[10]（および反射^{[11] ）を含む光学活性[8] [9]}も、物質の伝播方向に依存します。この場合、いわゆる外在的3dキラリティーは、光線と構造の相互配向に関連しています。

は通常測定されますが、歴史的な理由から、ほとんどの測定値は楕円率で報告されます。モル楕円率は、濃度に対して補正された円二色性です。モル円二色性とモル楕円率 は、次の式で簡単に相互変換できます。 ${\displaystyle \デルタA}$${\displaystyle [\theta ]}$

${\displaystyle [\theta ]=3298.2\,\Delta \varepsilon .\,}$

この関係は、偏光の楕円率を次のように定義することによって導き出されます。

${\displaystyle \tan \theta ={\frac {E_{\mathrm {R} }-E_{\mathrm {L} }}{E_{\mathrm {R} }+E_{\mathrm {L} }}}\,}$

どこ

${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$およびは、それぞれ右円偏光と左円偏光の電場ベクトルの大きさです。${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$

が等しい場合（右円偏光と左円偏光の吸光度に差がない場合）、は 0° となり、光は直線偏光になります。 または のいずれかがゼロの場合（一方向の円偏光が完全に吸収される場合）、は 45° となり、光は円偏光になります。 ${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$${\displaystyle \theta }$${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$${\displaystyle \theta }$

一般に、円二色性効果は小さいため、は小さく、ラジアンとして近似できます。光の強度または放射照度、は電場ベクトルの 2 乗に比例するため、楕円率は次のようになります。 ${\displaystyle \tan \theta }$${\displaystyle \theta }$${\displaystyle I}$

${\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(I_{\mathrm {R} }^{1/2}-I_{\mathrm {L} }^{1/2})}{(I_{\mathrm {R} }^{1/2}+I_{\mathrm {L} }^{1/2})}}\,}$

次に、自然対数形式 のビールの法則を使用して I を代入すると、次のようになります。

${\displaystyle I=I_{0}\mathrm {e} ^{-A\ln 10}\,}$

楕円率は次のように表すことができます。

${\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}-\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}{(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}+\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}}={\frac {\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}-1}{\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}+1}}\,}$

なので、この式はテイラー級数の指数を一次に展開し、1と比較して の項を破棄し、ラジアンから度に変換することで近似できます。 ${\displaystyle \Delta A\ll 1}$${\displaystyle \Delta A}$

${\displaystyle \theta ({\text{degrees}})=\Delta A\left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)\,}$

溶質濃度と経路長の線形依存性は、モル楕円率を次のように定義することで除去される。

${\displaystyle [\theta ]={\frac {100\theta }{Cl}}\,}$

最後の 2 つの式をビールの法則と組み合わせると、モル楕円率は次のようになります。

${\displaystyle [\theta ]=100\,\Delta \varepsilon \left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)=3298.2\,\Delta \varepsilon \,}$

モル楕円率の単位は歴史的には (deg·cm ² /dmol) です。モル楕円率を計算するには、サンプル濃度 (g/L)、セル経路長 (cm)、および分子量 (g/mol) を知っておく必要があります。

サンプルがタンパク質の場合、分子量の代わりに平均残基重量（含まれるアミノ酸残基の平均分子量）が使用されることが多く、基本的にタンパク質はアミノ酸の溶液として扱われます。平均残基楕円率を使用すると、異なる分子量のタンパク質の CD を比較しやすくなります。この正規化された CD の使用は、タンパク質構造の研究において重要です。

特にポリマー、タンパク質、ポリペプチドの二次構造を推定する方法では、測定されたモル楕円率スペクトルを正規化された値、具体的にはポリマーの長さに依存しない値に変換する必要があることがよくあります。この目的には平均残基楕円率が使用されます。これは、分子の測定されたモル楕円率を分子内のモノマー単位 (残基) の数で割った値です。

一般的に、この現象は光学活性分子の吸収帯で現れます。その結果、生物学的分子は右旋性および左旋性成分のため円二色性を示します。さらに重要なのは、二次構造もそれぞれの分子に明確な CD を与えるということです。したがって、タンパク質のアルファ ヘリックスと核酸の二重ヘリックスには、その構造を表す CD スペクトル特性があります。CD は代表的な構造特性を与えることができるため、現代の生化学において強力なツールとなり、ほぼすべての研究分野で応用されています。

CD は旋光分散(ORD) 技術と密接に関連しており、一般的にはより高度な技術であると考えられています。CD は対象分子の吸収帯またはその付近で測定されますが、ORD はこれらの帯から離れたところで測定できます。CD の利点はデータ解析で明らかです。記録された帯が ORD のように特定の波長で広範囲に重なることがないため、構造要素はより明確に区別されます。原理的には、すべての吸収が測定に含まれている場合、これら 2 つのスペクトル測定は積分変換 (クラマース-クローニッヒ関係) によって相互変換できます。

タンパク質の遠紫外線CDスペクトルは、その二次構造の重要な特性を明らかにすることができる。CDスペクトルは、分子がαヘリックス構造、βシート構造、βターン構造、またはその他の構造（ランダムコイルなど）にある割合を容易に推定するために使用することができる。^{[13] [14] [15] [16]}これらの割合の割り当ては、タンパク質がとり得る二次構造に重要な制約を課す。CDは一般に、検出されたαヘリックスが分子内のどこに位置しているかを言うことはできず、その数を完全に予測することさえできない。それにもかかわらず、CDは、特に構造の変化を示すための貴重なツールである。例えば、分子の二次構造が温度や変性剤（グアニジニウム塩化物や尿素など）の濃度の関数としてどのように変化するかを調べるために使用することができる。このようにして、他の方法では容易に得られない分子に関する重要な熱力学的情報（エンタルピーや変性のギブス自由エネルギーなど）を明らかにすることができます。タンパク質を研究しようとする人は誰でも、タンパク質が本来の立体構造にあることを、大規模で高価な実験を行う前に確認するための貴重なツールとして CD に気付くでしょう。また、タンパク質化学では、α ヘリックス分率の推定とは関係なく、CD 分光法が他の用途で使用されています。さらに、CD 分光法は生体無機界面の研究にも使用されています。具体的には、試薬による滴定前後の人工タンパク質の二次構造の違いを分析するために使用されています。^[17]

タンパク質の近紫外 CD スペクトル (>250 nm) は、三次構造に関する情報を提供します。250～300 nm 領域で得られる信号は、フェニルアラニン、チロシン、システイン (または SSジスルフィド結合)、トリプトファンアミノ酸の吸収、双極子配向、および周囲環境の性質によるものです。遠紫外 CD とは異なり、近紫外 CD スペクトルを特定の 3D 構造に割り当てることはできません。むしろ、近紫外 CD スペクトルは、ヘモグロビンやシトクロム cのヘム基など、タンパク質の補欠分子族の性質に関する構造情報を提供します。

可視 CD 分光法は、金属とタンパク質の相互作用を研究するための非常に強力な技術であり、個々の d-d 電子遷移を別々のバンドとして分解できます。可視光領域の CD スペクトルは、金属イオンがキラル環境にある場合にのみ生成されるため、溶液中の自由金属イオンは検出されません。これには、タンパク質に結合した金属のみを観察できるという利点があり、そのため pH 依存性と化学量論が容易に得られます。遷移金属イオン錯体の光学活性は、構成効果、コンフォメーション効果、および隣接効果に起因すると考えられています。Klewpatinond と Viles (2007) は、ヒスチジンと主鎖の配位を含む Cu ²⁺および Ni ^{2+平面四角形錯体の可視 CD スペクトルの出現を予測するための一連の経験則を作成しました。}

CD は、例えば原子分解能データを提供するX 線結晶構造解析やタンパク質 NMR分光法に比べると、構造に関する具体的な情報はあまり提供しません。しかし、CD 分光法は大量のタンパク質や大規模なデータ処理を必要としない迅速な方法です。そのため、CD は、温度、pH、塩分濃度、さまざまな補因子の存在など、 さまざまな溶媒条件を調べるために使用できます。

CD分光法は通常、溶液中のタンパク質を研究するために使用され、固体状態を研究する方法を補完します。これはまた、多くのタンパク質が本来の状態で膜に埋め込まれており、膜構造を含む溶液はしばしば強く散乱するという点で、限界でもあります。CD は薄膜で測定されることもあります。

CD分光法は、 _TiO2などの半導体材料を使用して、生体分子の電子遷移が頻繁に起こるUV波長範囲で大きな信号を得るためにも行われてきました。^[18]

CDは炭水化物でも研究されてきたが、真空紫外線（VUV）領域（100～200 nm）でのCDスペクトルの測定に関連する実験上の困難さのため、限られた成功しか収められていない。この領域には、非置換炭水化物の対応するCDバンドが存在する。VUV領域より上のバンドを持つ置換炭水化物は、測定に成功している。

また、CD の測定は、一般的な水性緩衝系が構造的特徴によって円偏光の示差吸収が見られる範囲で吸収を示すことが多いため、複雑になっています。リン酸、硫酸、炭酸、酢酸緩衝液は、10～50 mM の範囲など極端に希釈しない限り、一般的に CD と互換性がありません。遠紫外線 CD を実行する場合は、TRIS 緩衝系は完全に使用しないでください。ホウ酸およびオニウム化合物は、CD 実験の適切な pH 範囲を確立するためによく使用されます。フッ化物は遠紫外線での吸収が少ないため、塩化物イオンの代わりにフッ化物を使用する実験者もおり、純水で実験する人もいます。ほぼ普遍的なもう 1 つの手法は、遠紫外線で作業するときに、より短い光路長のセルを使用することによって溶媒の吸収を最小限に抑えることです。この作業では、0.1 mm の光路長は珍しくありません。

水性システムでの測定に加えて、CD、特に遠紫外線CDは、エタノール、メタノール、トリフルオロエタノール（TFE）などの有機溶媒でも測定できます。後者は、タンパク質の構造形成を誘導する利点があり、一部のタンパク質ではベータシートを、他のタンパク質ではアルファヘリックスを誘導しますが、これは通常の水性条件下では示されません。ただし、アセトニトリル、THF、クロロホルム、ジクロロメタンなどの最も一般的な有機溶媒は、遠紫外線CDと互換性がありません。

二次構造推定に使用されるタンパク質 CD スペクトルは、アミノ酸を結合するアミド結合の π から π* 軌道の吸収に関連していることに注目すると興味深いかもしれません。これらの吸収帯は、いわゆる 真空紫外線(波長約 200 nm 未満) に一部存在します。これらの波長では酸素による光の強い吸収のため、対象の波長領域は実際には空気中ではアクセスできません。実際には、これらのスペクトルは真空中ではなく、酸素のない機器 (純粋な窒素ガスで満たされた) で測定されます。

酸素が除去されたら、200 nm 未満で動作するための 2 番目に重要な技術的要素は、おそらく、この領域での損失が低くなるように光学システムの残りの部分を設計することです。この点で重要なのは、このスペクトル領域での損失が低くなるようにコーティングが最適化されたアルミニウム ミラーを使用することです。

これらの機器の通常の光源は、高圧のショートアークキセノンランプです。通常のキセノンアークランプは、低紫外線での使用には適していません。代わりに、高純度の合成石英ガラスで作られたエンベロープを備えた特別に設計されたランプを使用する必要があります。

シンクロトロン光源からの光は短波長で非常に高い光束を持ち、160 nmまでのCDを記録するために使用されています。2010年には、デンマークのオーフス大学の電子蓄積リング施設ISAのCD分光光度計を使用して、120 nmまでの固体CDスペクトルが記録されました。^[19]量子力学的レベル では、円偏光二色性と光学回転の特徴密度は同一です。光学回転分散と円偏光二色性は同じ量子情報コンテンツを共有しています。

• 商業サービスプロバイダーであるAlliance Protein Laboratoriesによる円二色性分光法
• 機器サプライヤーApplied Photophysicsによる円二色性分光法入門
• Valev 教授による円二色性と旋光性に関するアニメーションによるステップバイステップのチュートリアル。