核オーバーハウザー効果

核オーバーハウザー効果( NOE ) は、スピン活性核 (例: 1 H、13 C、15 N など) の 1 つの集団から別の集団へ、相互緩和を介して核スピン分極が移行することです。核磁気^共鳴分光^法( ^NMR )におけるNOEの現象論的定義は、 RF フィールドの照射によって別の共鳴が飽和したときに発生する 1 つの NMR 共鳴の積分強度 (正または負) の変化です。核の共鳴強度の変化は、核が空間的に RF 摂動によって直接影響を受ける核に近い結果です。

NOE は、NMR 共鳴の割り当て、および有機分子や生体分子の構造や構成の解明と確認において特に重要です。1 ^H 2 次元 NOE 分光法 (NOESY) 実験とその拡張は、溶液中のタンパク質やその他の生体分子の立体化学を特定するための重要なツールですが、固体状態では、立体化学の特定に結晶 X 線回折が一般的に使用されます。^[1]^[2]^[3]異核 NOE は、¹³ C NMR 分光法において、プロトンに結合した炭素を特定し、そのような炭素に分極増強を提供して信号対雑音比を高め、これらの炭素の緩和が双極子間緩和機構によって制御される程度を確認するために特に重要です。^[4]

歴史

NOE は、1953 年にアメリカの物理学者アルバート・オーバーハウザーの理論的研究から発展しました。オーバーハウザーは、特定の金属の伝導電子にマイクロ波を照射すると、核スピン分極が強化される可能性があると 1953 年に提唱しました。 ^[5]オーバーハウザーによって予測された電子核強化は、同じく 1953 年に TR カーバーと CP スリヒターによって^{7 Li 金属で実験的に実証されました。}^[6] HF 分子の核スピンのみに関係するオーバーハウザー効果の一般的な理論的根拠と実験的観察は、1955 年にイオネル・ソロモンによって発表されました。 ^[7] NOE の別の初期の実験的観察は、1963 年にカイザーによって使用され、NOE を使用してスカラー結合定数の相対的な符号を決定し、NMR スペクトルのスペクトル線をエネルギーレベル間の遷移に割り当てる方法を示しました。この研究では、有機分子内の 1 つの陽子集団 ( ¹ H)の共鳴が、同じ有機分子内の 2 つ目の異なる陽子集団がRF 照射によって飽和したときに強化されました。 ^[8] NOEの応用は、1965年にAnetとBournによってβ,β-ジメチルアクリル酸とジメチルホルムアミドのNMR共鳴の割り当てを確認するために使用され、それによって溶液中の有機分子の立体配座と配置情報が得られることが示されました。^[9] BellとSaundersは1970年にNOE増強と核間距離の直接的な相関関係を報告しました^[10] 一方、3つ以上のスピンを持つ分子の核間距離の定量的な測定はSchirmerらによって報告されました。^[11]

リチャード・R・エルンストは、フーリエ変換と2次元NMR分光法の開発により1991年のノーベル化学賞を受賞しました。この分光法はすぐにNOEの測定に応用され、特に大きな生体分子で広く利用されるようになりました。 ^[12] 2002年、クルト・ヴュトリッヒは、溶液中の生体高分子の3次元構造を決定するための核磁気共鳴分光法の開発によりノーベル化学賞を受賞しました。この分光法は、2D NOE法（NOESY）を使用して大きな生体高分子の3次元構造を制限する方法を実証しました。 ^[13]アニル・クマール教授は、2次元核オーバーハウザー効果（2D-NOE、現在はNOESYとして知られています）実験を生体分子に適用した最初の人物であり、NMR分光法による溶液中の生体分子の3次元構造の決定の分野を切り開きました。^[14]

リラクゼーション

NOE と核スピン格子緩和は密接に関連した現象です。磁場中の単一のスピン1 ⁄ 2核には、 α と β と呼ばれることが多い 2 つのエネルギーレベルがあり、それぞれ + 1 ⁄ 2と - 1 ⁄ 2という 2 つのスピン量子状態に対応します。熱平衡では、2 つのエネルギーレベルの分布は、スピン分布がP _αとP _βで与えられるボルツマン分布によって決まります。スピン分布が遷移エネルギー周波数で適切な RF フィールドによって摂動されると、スピン分布はスピン格子緩和と呼ばれるプロセスによって熱平衡に戻ります。α から β への遷移速度は状態 α の分布P _{αに比例し、速度定数}Wを持つ一次プロセスです。連続的なRF照射によってスピン分布が均一化された状態（P _α = P _{β ）は}飽和と呼ばれ、遷移確率はエネルギーレベル間の分布の差に依存するため共鳴は消失します。

NOE が関係する最も単純なケースでは、2 つのスピン1 ⁄ 2核 I と S の共鳴は化学的にシフトしているが、J 結合はしていない。このようなシステムのエネルギー図には、それぞれ αα、αβ、βα、ββ に対応する I と S のスピン状態に依存する 4 つのエネルギーレベルがある。W は、4 つのエネルギーレベル間で遷移が発生する単位時間あたりの確率、または言い換えると、対応するスピン反転が発生する速度である。αα ➞ βα と αβ ➞ ββ に対応する2 つの単一量子遷移W ₁^{I 、αα ➞ αβ と βα ➞ ββ に対応する}W ₁^S、βα ➞ αβ に対応するゼロ量子遷移W ₀、および αα ➞ ββ に対応する二重量子遷移がある。

高周波照射は（いわゆる量子力学の選択則により）単一量子遷移のみを誘発し、観測可能なスペクトル線を生じさせますが、双極子緩和はどの経路でも起こり得ます。双極子機構は、複数のスピンが反転する遷移を引き起こすことができる唯一の一般的な緩和機構です。具体的には、双極子緩和機構は、αα状態とββ状態（W ₂）の間、およびαβ状態とβα状態（W ₀）の間の遷移を引き起こします。

バルクNMR磁化で表すと、核Sの共鳴が飽和しているとき（）の核Iの実験的に観測された定常NOEは、次の式で定義されます。 $M_{S}=0$

\eta _{I}^{S}=\left({\frac {M_{I}^{S}-M_{0I}}{M_{0I}}}\right)

ここで、は熱平衡における原子核の磁化（共鳴強度）である。NOEの解析的表現は、すべての緩和経路を考慮し、ソロモン方程式を適用して得ることができる。 $M_{0I}$ $I$

\eta _{I}^{S}={\frac {M_{I}^{S}-M_{0I}}{M_{0I}}}={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}{\frac {\sigma _{IS}}{\rho _{I}}}={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left({\frac {W_{2}-W_{0}}{2W_{1}^{I}+W_{0}+W_{2}}}\right)

どこ

\rho _{I}=2W_{1}^{I}+W_{0}+W_{2}

そして。

\sigma _{IS}=W_{2}-W_{0}

$\rho _{I}$ は、スピンsの存在によるスピンIの全縦方向双極子緩和率 ( ) であり、は交差緩和率と呼ばれ、およびはそれぞれ、およびの核に特徴的な磁気回転比です。 $1/T_{1}$ $\sigma _{IS}$ $\gamma _{I}$ $\gamma _{S}$ $I$ $S$

縮退したW ₁^S遷移の飽和により平衡ポピュレーションが乱され、P _αα = P _αβおよびP _βα = P _ββとなる。ただし、システムの緩和経路はアクティブなままで、平衡を再確立するように動作する。ただし、W ₁^S遷移は無関係である。これは、これらの遷移間のポピュレーション差は RF 照射によって固定されるのに対し、W _I遷移間のポピュレーション差は平衡値から変化しないためである。つまり、単一量子遷移のみが緩和経路としてアクティブであれば、共鳴を飽和させても共鳴の強度には影響しない。したがって、I の共鳴強度に関する NOE を観察するには、およびの寄与が重要である必要がある。相互緩和経路として知られるこれらの経路は、緩和が双極子間またはスカラー結合相互作用によって支配されている場合にのみ、スピン格子緩和に大きく寄与するが、スカラー相互作用が重要になることはめったになく、無視できると想定される。等核の場合、が優勢な緩和経路であれば、を飽和させると共鳴の強度が増し、NOE は正になります。一方、が優勢な緩和経路であれば、を飽和させると共鳴の強度が減り、NOE は負になります。 $S$ $I$ $W_{0}$ $W_{2}$ $\gamma _{I}=\gamma _{S}$ $W_{2}$ $S$ $I$ $W_{0}$ $S$ $I$

分子運動

NOE が正か負かは、分子の回転運動の度合いに敏感に依存する。^[3] 3 つの双極子緩和経路は、いくつかの要因に応じてスピン格子緩和に異なる程度に寄与する。重要な要因の 1 つは、ω ₂、ω ₁、ω ₀のバランスが、分子の回転相関時間、つまり分子が 1 ラジアン回転するのにかかる時間によって大きく左右されるということである。NMR 理論によれば、遷移確率は、ラーモア歳差運動周波数、に次の関係で関連している。 $\tau _{c}$ $\tau _{c}$ $\omega$

W_{1}^{I}\propto {\frac {3\tau _{c}}{(1+\omega _{I}^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}

W_{0}\propto {\frac {2\tau _{c}}{(1+(\omega _{I}-\omega _{S})^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}

W_{2}\propto {\frac {12\tau _{c}}{(1+(\omega _{I}+\omega _{S})^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}

ここで、は2 つのスピン1 ⁄ 2核を隔てる距離です。緩和が起こるためには、分子の回転周波数が核のラーモア周波数と一致している必要があります。可動溶媒では、分子の回転運動はよりもはるかに高速です。いわゆる極端に狭まる限界( )。これらの条件下では、 τ _cと 2ω _{0 がτ}_cと ω ₁よりもよく一致するため、二重量子緩和 W _{2は W}₁や W ₀よりも効果的です。 ω _{2 が}主要な緩和過程である場合、正の NOE が生じます。 $r$ $\omega$ $\omega \tau _{c}\ll 1$

W_{1}^{I}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {3\tau _{c}}{r^{6}}}

W_{0}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}

W_{2}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}

\eta _{I}^{S}(max)={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left[{\frac {{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}-{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}}{{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}+2{\frac {3\tau _{c}}{r^{6}}}+{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}}}\right]={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left[{\frac {12-2}{2+6+12}}\right]={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}{\frac {1}{2}}

この式は、 I = Sである同核の場合、特に¹H NMR の場合、観測できる最大 NOE は核の近接性に関係なく 1\2 であることを示しています。I ≠ Sである異核の場合、最大 NOE は 1\2 ( γ _S / γ _I )で与えられ、広帯域プロトンデカップリングの条件下で異核を観測する場合、感度が大幅に向上します。有機化学で最も重要な例は、¹ H をデカップリングしながら^{13 C を観測することです。これにより、}^{1 J 共鳴も飽和します。}γ _S / γ _Iの値は4 に近く、最大 NOE 増強は 200% となり、NOE がない場合の 3 倍の強さの共鳴が生じます。^[15]多くの場合、炭素原子にはプロトンが結合しており、これにより緩和は双極子緩和によって支配され、NOE は最大に近くなります。プロトン化されていない炭素原子の場合、NOE の増大は小さいですが、双極子間相互作用以外の緩和メカニズムによって緩和する炭素の場合、NOE の増大は大幅に減少する可能性があります。これが、^{13 C NMR で重水素化溶媒 (}CDCl ₃など)を使用する理由の 1 つです。重水素は四極子メカニズムによって緩和するため、相互緩和経路はなく、NOE は存在しません。もう 1 つの重要なケースは¹⁵ N で、磁気回転比の値が負になる例です。1 ^{H核が分離されると、}¹⁵ N 共鳴が減少するか、NOE によって実際に共鳴がゼロになることがよくあります。負の NOE を最小限に抑えるには、通常、プロトンから¹⁵ Nへの分極移動を伴うパルス技術を使用してこのようなスペクトルを取得することが有利です。

構造解明

定常状態の NOE と核間距離の関係は、緩和速度と分子運動に依存して複雑ですが、極限狭まりの極限で急速に回転する小さな分子の場合、正の NOE の半定量的性質は、多くの場合 J 結合定数の測定と組み合わせて、多くの構造アプリケーションに役立ちます。たとえば、NOE の増強は、NMR 共鳴の割り当てを確認したり、構造異性体を区別したり、芳香族環の置換パターンや脂肪族置換基の構成を特定したり、コンフォメーションの好みを決定したりするために使用できます。^[3]

それでも、観測された NOE から導かれる原子間距離は、分子の 3 次元構造を確認するのに役立つことがよくあります。^[3]^{[15]この用途では、NOE は}J カップリングの用途とは異なり、化学結合ではなく空間を介して発生します。したがって、互いに近接している原子は NOE を与えることができますが、スピンカップリングは原子が 2～3 の化学結合で接続されている場合にのみ観察されます。ただし、関係η _I^S (max)= 1 ⁄ 2は、緩和が 2 つの核 I と S の間の双極子間相互作用によって 100% 支配される理想的な場合にのみ適用されるため、NOE が核間距離とどのように関連しているかを不明瞭にします。実際には、ρ _{Iの値には他の競合するメカニズムの寄与が含まれており、これは}W _{1 を}増加させることでW ₀とW ₂の影響を減らすだけです。例えば、溶媒中の溶存酸素や常磁性金属イオン不純物との電子核相互作用による緩和により、弱いNOE増強の観測が妨げられることがある。他の緩和メカニズムの存在下で観測されるNOEは次のように表される。

\eta _{I}={\frac {\sigma _{IS}}{\rho _{I}+\rho ^{*}}}

ここで、ρ ^{⋇ は}交差緩和を伴わない緩和機構からの全緩和率への追加寄与である。極限狭窄限界における双極子緩和に対して同じ理想化された2スピンモデルを使用すると、次のようになる。

\rho _{I}\propto {\frac {\tau _{c}}{r^{6}}}

^[15]は簡単に示せる。

\eta _{I}^{S}\propto \left({\frac {\tau _{c}}{\rho ^{*}}}\right){\frac {1}{r^{6}}}

このように、2スピン定常状態NOEは、外部緩和の寄与がある場合にのみ核間距離に依存する。BellとSaundersは、厳密な仮定に従うと、極限狭窄極限では類似の分子に対してρ ^⋇ /τ _{cがほぼ一定であることを示した。}^[10] したがって、定常状態NOE値の比をとることで、核間距離rの相対値を得ることができる。定常状態実験は多くの場合有用であるが、相対的な核間距離に関する情報しか提供できない。一方、NOEが増加する初期速度はr _IS⁻⁶に比例し、これは2D-NOESYなどの過渡実験を介して構造情報を取得するためのより洗練された代替手段を提供する。

2次元NMR

NOE の測定に 2 次元 NMR を使用する理由は、他の 2 次元法の場合と同様です。影響を受ける共鳴を 2 次元に広げることで最大解像度が向上し、そのためより多くのピークが分離され、より大きな分子を観測でき、1 回の測定でより多くの NOE を観測できます。さらに重要なのは、分子運動が中程度または低速の運動状態にあり、NOE がゼロまたは負の場合、定常 NOE 実験では核間距離に関連する結果が得られないことです。^[3]

核オーバーハウザー効果分光法 (NOESY) は、相互緩和を受けている核スピンを識別し、その相互緩和率を測定するために使用される 2D NMR 分光法です。¹ H 双極子間結合は、溶液中の有機分子の相互緩和の主な手段であるため、相互緩和を受けているスピンは、空間的に互いに近いスピンです。したがって、NOESY スペクトルの交差ピークは、空間的にどのプロトンが互いに近いかを示します。この点で、NOESY 実験は、スピン間相関を提供するために J 結合に依存し、交差ピークは分子の化学結合を通じてどの¹ H が他のどの^{1 H に近いかを示す COSY 実験とは異なります。}

基本的な NOESY シーケンスは、3 つの 90° パルスで構成されています。最初のパルスは、横方向のスピン磁化を生成します。スピンは、2D 実験の過程で増加する発展時間 t ₁の間に歳差運動します。2 番目のパルスは、パルス方向に直交する横方向の磁化成分に等しい縦方向の磁化を生成します。したがって、その考え方は、混合期間 τ _mの初期条件を生成することです。NOE 混合時間中、交差緩和による磁化移動が発生する可能性があります。基本的な NOESY 実験では、 τ _{m は}2D 実験全体を通じて一定に保たれますが、最適な交差緩和率と NOE の増加に合わせて選択されます。3 番目のパルスは、残りの縦方向の磁化から横方向の磁化を生成します。データ取得は、3 番目のパルスの直後に開始され、横方向の磁化は、パルス遅延時間 t _{2の関数として観測されます。NOESY スペクトルは、 t}₁および t ₂に関する 2D フーリエ変換によって生成されます。混合時間を増やしながら一連の実験を実行し、NOE の増大を追跡します。最も近い陽子は、NOE の最も急速な増加率を示します。

陽子間距離は、クロスピーク強度の分析によって、明確に割り当てられた、十分に分解された、高い信号対雑音比のNOESYスペクトルから決定できます。これらは体積積分によって得られ、陽子間距離の推定値に変換できます。2つの原子間の距離は、クロスピーク体積とスケーリング定数から計算できます。 $i$ $j$ $V$ $c$

r_{\text{NOE}}=\left({\frac {c}{V_{ij}}}\right)^{1/6}

ここで、は既知の固定距離の測定に基づいて決定できます。距離の範囲は、スペクトル内の既知の距離と体積に基づいて報告され、平均と標準偏差、ピークを示さないNOESYスペクトル内の複数の領域の測定値、つまりノイズ、および測定誤差が示されます。パラメータは、すべての既知の距離が誤差範囲内になるように設定されます。これは、NOESY体積の下限範囲を表示できることを示しています。 $c$ $c$ $c_{SD}$ $V_{\rm {err}}$ $m_{v}$ $x$

r_{\text{NOE lower}}=\left({\frac {c-xc_{SD}}{{\frac {1}{m_{v}}}V_{ij}+V_{\rm {err}}}}\right)^{1/6}

そして上限は

r_{\text{NOE higher}}=\left({\frac {c+xc_{SD}}{{\frac {1}{m_{v}}}V_{ij}-V_{\rm {err}}}}\right)^{1/6}

このような固定距離は研究対象のシステムによって異なります。例えば、ロックされた核酸には糖内で距離がほとんど変わらない原子が多数含まれているため、グリコシドねじれ角を推定することができ、NMRでLNA分子動力学予測のベンチマークを行うことができました。^[16] しかし、RNAにははるかに構造的に柔軟な糖があり、下限と上限のより広い推定が必要です。^[17]

タンパク質の構造特性評価では、NOE は分子内距離に制約を作成するために使用されます。この方法では、各プロトン対が個別に考慮され、NOESY クロスピークの強度が、ジェミナルメチレンプロトン対や芳香環プロトンなどの固定距離のプロトン対からの参照クロスピークと比較されます。この単純なアプローチは、スピン拡散や不均一な相関時間の影響をかなり受けにくく、十分な数の NOE が特定されていれば、通常、タンパク質の全体的なフォールドの定義につながります。NOESY クロスピークは、強い、中程度、弱いに分類でき、それぞれ約 2.5、3.5、5.0 Å の上限距離制約に変換できます。このような制約は、分子力学最適化で使用して、タンパク質の溶液状態の立体配座の図を作成できます。^[18] 完全な構造決定は、化学シフト制約と NOESY 制約の両方を利用するさまざまな NMR 実験と最適化方法に依存しています。

異核NOE

いくつかの実験方法

NOE を活用した 1 次元および 2 次元 NMR 実験技術の例としては、次のものがあります。

NOESY、核オーバーハウザー効果分光法
HOESY、異核オーバーハウザー効果分光法
ROESY、回転フレーム核オーバーハウザー効果分光法
TRNOE、転移核オーバーハウザー効果
DPFGSE-NOE、二重パルス磁場勾配スピンエコーNOE実験

NOESYは、分子（例えばタンパク質や他の大きな生物学的分子）内の原子の相対的な向きを決定し、3次元構造を作り出す。HOESYは、異なる元素の原子間のNOESY相互相関である。ROESYは、磁化がゼロにならないようにスピンロックするものであり、通常のNOESYが適用できない分子に適用される。TRNOEは、タンパク質に結合するリガンドのように、同じ溶液中で相互作用する2つの異なる分子間のNOEを測定する。^[19] DPFGSE-NOE実験では、強い信号を抑制し、非常に小さなNOEを検出できる一時的な実験である。