均衡の展開

生化学において、平衡展開とは、温度や圧力、pHを変えたり、化学変性剤を加えたり、原子間力顕微鏡のチップのように力を加えたりして、徐々に環境を変化させることでタンパク質やRNA分子を展開する過程である。^{[1] [2]}すべての段階で平衡が維持されていれば、理論的には平衡展開中にプロセスは可逆的であるはずである。平衡展開は、タンパク質やRNA構造の熱力学的安定性、すなわち、展開状態と折り畳まれた状態の間の自由エネルギー差を決定するために使用できる。

最も単純な形式では、平衡展開では、分子は 2 つの熱力学的状態、つまり折り畳まれた状態(通常、 「ネイティブ」状態を表すNで示される) と折り畳まれていない状態 (通常、Uで示される)のみに属すると想定されます。この「全か無か」のタンパク質折り畳みモデルは、1945 年にTim Ansonによって初めて提案されましたが、 ^{[3]これはタンパク質の小さな単一}構造ドメインにのみ当てはまると考えられています (Jackson、1998)。より大きなドメインやマルチドメイン タンパク質は、中間状態を示すことがよくあります。統計力学では通常、これらの状態は分子の 1 つのコンフォメーションだけでなく、分子のコンフォメーションの 集合に対応します。

分子は、単純な運動モデルに従って、天然状態と未折り畳み状態の間を遷移する可能性がある。

N⇌U

はそれぞれ、折り畳み（）と展開（ ）反応の速度定数 とである。無次元平衡定数は、次の式によって コンフォメーション安定性を決定するために使用できる。${\displaystyle k_{f}}$${\displaystyle k_{u}}$${\displaystyle {\ce {U -> N}}}$${\displaystyle {\ce {N -> U}}}$ ${\displaystyle K_{eq}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{u}}{k_{f}}}={\frac {\left[{\ce {U}}\right]_{eq}}{\left[{\ce {N}}\right]_{eq}}}}$${\displaystyle \Delta G^{o}}$

${\displaystyle \Delta G^{o}=-RT\ln K_{eq}}$

ここで、は気体定数、 はケルビン単位の絶対温度です。したがって、展開状態が本来の状態に比べて不安定（つまり不利）な場合は、 は正になります。 ${\displaystyle R}$${\displaystyle T}$${\displaystyle \Delta G^{o}}$

2 状態フォールディングを持つ分子の立体構造安定性を測定する最も直接的な方法は、関心のある溶液条件下での運動速度定数とを測定することです。しかし、タンパク質のフォールディングは通常数ミリ秒で完了するため、このような測定は実行が難しく、通常は高価なストップトフローミキサーまたは (最近では) 連続フローミキサーを使用して、高時間分解能でフォールディングを誘発する必要があります。二重偏光干渉法は、立体構造の変化とを直接測定する新しい技術です。 ${\displaystyle \Delta G^{o}}$${\displaystyle k_{f}}$${\displaystyle k_{u}}$${\displaystyle \Delta G^{o}}$

より広範囲ではない平衡展開法では、溶液条件を、例えばグアニジン塩酸塩や尿素などの変性剤を加えるなどして、天然状態に適した状態から未展開状態に適した状態へと徐々に変化させながら、折り畳まれた分子と未展開の分子の割合（それぞれ と と表記）を測定します。（平衡折り畳み法では、逆のプロセスが実行されます。）割合の合計は 1 で、その比率はボルツマン因子で与えられるため、次の式が得られます。 ${\displaystyle p_{N}}$${\displaystyle p_{U}}$

${\displaystyle p_{N}={\frac {1}{1+e^{-\デルタ G/RT}}}}$

${\displaystyle p_{U}=1-p_{N}={\frac {e^{-\Delta G/RT}}{1+e^{-\Delta G/RT}}}={\frac { 1}{1+e^{\デルタ G/RT}}}}$

タンパク質の安定性は、通常、変性剤の濃度に比例して変化することが分かっています。この現象を説明するために、変性剤結合モデル、溶媒交換モデル（ともにJohn Schellman ^[4]による）、線形外挿モデル（LEM、Nick Pace ^[5]による）など、さまざまなモデルが提案されています。すべてのモデルは、変性時に2つの熱力学的状態のみが存在/非存在することを前提としています。これらのモデルは、より複雑な反応スキームを解釈するために拡張することができます。

変性剤結合モデルは、タンパク質分子（折り畳まれた状態または折り畳まれていない状態）上に、変性剤が有効（平均）結合定数kで結合する特定の独立した部位があると仮定しています。 変性剤の濃度が高い場合、折り畳まれた状態に比べて変性剤の結合部位が多くなるため、平衡は折り畳​​まれていない状態の方に移行します（）。 言い換えると、折り畳まれていない状態で露出する潜在的な部位の数が増えることが、変性遷移の理由であると考えられます。 基本的な処理により、次の関数形式が得られます。 ${\displaystyle \Delta n}$

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+k[D]\right)}$

ここで、は水中でのタンパク質の安定性、[D]は変性剤の濃度です。したがって、このモデルによる変性データの分析には、、、k、および折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態のベースラインの傾きと切片の 7つのパラメーターが必要です。${\displaystyle \Delta G_{w}}$${\displaystyle \Delta G_{w}}$${\displaystyle \Delta n}$

シェルマンの溶媒交換モデル（「弱結合モデル」または「選択的溶媒和」とも呼ばれる）は、タンパク質上の独立した部位に結合した水分子と溶液中の変性分子との間の平衡という考えを呼び起こします。その形式は次のとおりです。

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+(K-1)X_{D}\right)}$

ここで、は交換反応の平衡定数、は溶液中の変性剤のモル分率です。このモデルは、変性剤分子が実際にタンパク質に結合するのか、それとも、実験で使用される高濃度で変性剤が溶液全体の約 20 ～ 30% を占めるため、結合しているように見えるだけなのか (つまり、非特異的効果) という疑問に答えようとしています。そのため、「弱い結合」という用語が使用されています。変性剤結合モデルと同様に、このモデルに適合させるには 7 つのパラメーターが必要です。これら 2 つのモデルから得られる共通のテーマの 1 つは、尿素とグアニジニウム塩酸塩の結合定数 (モル スケール) が小さいことです。尿素の場合は約 0.2、GuHCl の場合は 0.6 です。 ${\displaystyle K}$${\displaystyle X_{d}}$${\displaystyle M^{-1}}$${\displaystyle M^{-1}}$

直感的に、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の間の結合部位の数の差は、アクセス可能な表面積の差に正比例します。これが、安定性が変性剤濃度に単純に線形依存すると仮定するLEMの基礎となります。安定性と変性剤濃度のグラフの傾きは、m 値と呼ばれます。純粋に数学的に言えば、m 値は変性剤の添加による安定化自由エネルギーの変化の導関数です。しかし、Pace と同僚は、折り畳まれていない状態で露出するアクセス可能な表面積 (ASA)、つまり研究対象のタンパク質の折り畳まれていない状態と折り畳まれた状態の間の ASA の差 (dASA) と m 値の間に強い相関関係があることを文書化しました。^[5]この観察結果から、m 値は通常、dASA に比例すると解釈されます。LEM には物理的な根拠はなく、純粋に経験的ですが、溶媒変性データの解釈に広く使用されています。LEM の一般的な形式は次のとおりです。

${\displaystyle \Delta G=m\left([D]_{1/2}-[D]\right)}$

ここで、傾きは「m値」（上記の定義では> 0）と呼ばれ、（C _mとも呼ばれる）は分子の50％が折り畳まれる変性剤濃度（遷移の変性中間点、 ）を表します。 ${\displaystyle m}$${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$${\displaystyle p_{N}=p_{U}=1/2}$

実際には、異なる変性剤濃度で観測された実験データは、 に対するこの機能形式と、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の線形ベースラインを持つ 2 状態モデルにフィッティングされます。と は2 つのフィッティング パラメーターであり、線形ベースラインの他の 4 つのパラメーター (各ラインの傾きと切片) も含まれます。場合によっては、傾きが 0 であると想定され、合計 4 つのフィッティング パラメーターになります。適合パラメーターおよび から、任意の変性剤濃度 (変性剤ゼロでの安定性を含む) に対する立体配座の安定性を計算できます。 折り畳みに関する速度論データと組み合わせると、m値を使用して、折り畳み遷移状態で埋め込まれた疎水性表面の量を大まかに推定できます。 ${\displaystyle \デルタG}$${\displaystyle m}$${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$${\displaystyle \デルタG}$${\displaystyle m}$${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$

残念ながら、確率とを直接測定することはできません。代わりに、さまざまな構造プローブを使用して、折り畳まれた分子の相対的な集団を分析します。たとえば、287 nm での吸光度(トリプトファンとチロシンの溶媒への露出を報告します)、遠紫外線円二色性 (180-250 nm、タンパク質バックボーンの二次構造を報告します)、二重偏光干渉法(分子のサイズと折り畳み密度を報告します)、および近紫外線蛍光(トリプトファンとチロシンの環境の変化を報告します) などです。ただし、折り畳まれた構造のほぼすべてのプローブを使用できます。測定は平衡状態で行われるため、高い時間分解能は必要ありません。したがって、NMR化学シフト、固有粘度、システインなどの側鎖の溶媒への露出 (化学反応性)、プロテアーゼへのバックボーンの露出、およびさまざまな流体力学的測定を測定できます。 ${\displaystyle p_{N}}$${\displaystyle p_{U}}$

これらの観測値を確率およびに変換するには、観測値がそれぞれ本来の状態または展開状態に対応する2つの値または のいずれかを取ると仮定するのが一般的です。したがって、観測値は線形和に等しくなります。 ${\displaystyle p_{N}}$${\displaystyle p_{U}}$${\displaystyle A}$${\displaystyle A_{N}}$${\displaystyle A_{U}}$

${\displaystyle A=A_{N}p_{N}+A_{U}p_{U}}$

さまざまな溶液条件下での の観測値をこの関数形式に当てはめると、 および、および のパラメータを推定できます。 の漸近線が強く折り畳まれた状態または強く折り畳まれていない状態で線形に変化することが観測される場合、フィッティング変数およびは、温度や変性剤の濃度などの溶液条件とともに線形に変化することが許可されることがあります。 ${\displaystyle A}$${\displaystyle A_{N}}$${\displaystyle A_{U}}$${\displaystyle \デルタG}$${\displaystyle A_{N}}$${\displaystyle A_{U}}$${\displaystyle A}$

上で述べたように 2 状態の変性を想定すると、調査対象のシステムの に関する 知識があれば、基本的な熱力学パラメータ、つまりを導くことができます。${\displaystyle \Delta H}$${\displaystyle \デルタS}$${\displaystyle \デルタG}$${\displaystyle \Delta C_{p}}$

変性の熱力学的観測値は次の式で記述できます。

${\displaystyle {\begin{aligned}\Delta H(T)&=\Delta H(T_{d})+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT\\&=\Delta H(T_{d})+\Delta C_{p}[T-T_{d}]\\\Delta S(T)&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\Delta C_{p}\ln {\frac {T}{T_{d}}}\\\Delta G(T)&=\Delta HT\Delta S\\&=\Delta H(T_{d}){\frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT-T\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&=\Delta H(T_{d})\left(1-{\frac {T}{T_{d}}}\right)-\Delta C_{p}\left[T_{d}-T+T\ln \left({\frac {T}{T_{d}}}\right)\right]\end{aligned}}}$

ここで、、およびは、一定の pH および圧力下での展開のエンタルピー、エントロピー、およびギブスの自由エネルギーを示します。温度は、システムの熱安定性を調べるために変化し、はシステム内の分子の半分が展開する温度です。最後の式は、ギブス・ヘルムホルツ式として知られています。 ${\displaystyle \\Delta H}$${\displaystyle \\デルタS}$${\displaystyle \\デルタG}$${\displaystyle \T}$${\displaystyle \T_{d}}$

原理的には、が温度に依存しないと仮定すると、システムの単一の示差走査熱量測定サーモグラムから上記のすべての熱力学的観測値を計算できます。ただし、この方法で の正確な値を取得するのは困難です。より正確には、は対の変化から導き出すことができます。これは、 pHまたはタンパク質濃度のわずかな変化を伴う測定から得られます。線形近似の傾きは に等しくなります。データポイントの非線形性は、 が温度に依存 しない可能性があることを示していることに注意してください。${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$${\displaystyle {\ce {\Delta H(T_d)}}}$${\displaystyle {\ce {T_d}}}$${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$${\displaystyle \Delta C_{p}}$

あるいは、熱変性前と熱変性後のタンパク質のアクセス可能な表面積(ASA) を次のよう に計算して推定することもできます。${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$

${\displaystyle {\ce {\Delta ASA}}={\ce {ASA_{展開済み}}}-{\ce {ASA_{ネイティブ}}}$

3D 構造が既知のタンパク質の場合、Deepview (スイス PDB ビューアとも呼ばれる) などのコンピュータ プログラムを使用して を計算できます。 は、各アミノ酸の表の値から半経験式を使用して計算できます。 ${\displaystyle {\ce {ASA_{ネイティブ}}}}$${\displaystyle {\ce {ASA_{展開済み}}}}$

${\displaystyle {\ce {ASA_{unfolded}}}=\left(a_{{\ce {polar}}}\time {\ce {ASA_{polar}}}\right)+\left(a_{{\ ce {芳香族}}}\times {\ce {ASA_{芳香族}}}\right)+\left(a_{{\ce {無極性}}}\times {\ce {ASA_{無極性}}}\右)}$

ここで、下付き文字の極性、非極性、芳香族は、20 種類の天然アミノ酸の部分を示します。

最後に、タンパク質については、次の式を通して、との間には線形相関関係がある： ^[6]${\displaystyle {\ce {\Delta ASA}}}$${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$

${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}=0.61\times {\ce {\Delta ASA}}}$

さらに、折り畳みが上記の 2 状態展開に従って進行するかどうかを評価することができます。これは、示差走査熱量測定法を使用して、熱量測定による変性エンタルピー (つまり、ピークの下の領域) を、次のように表されるファントホッフエンタルピーと比較することによって行うことができます。 ${\displaystyle A_{\text{peak}}}$

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T)=-R{\frac {d\ln K}{dT^{-1}}}}$

は次のように説明できます。 ${\displaystyle T=T_{d}}$${\displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})}$

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})={\frac {RT_{d}^{2}\Delta C_{p}^{\max }}{A_{\text{peak}}}}}$

2 状態の展開が観察される場合、は熱容量ピークの高さです。 ${\displaystyle A_{\text{peak}}=\Delta H_{vH}(T_{d})}$${\displaystyle \Delta C_{p}^{\max }}$

上記の原理を使用して、モノマーから三量体、そして潜在的には四量体までのホモマーおよびヘテロマータンパク質について、平衡状態の折り畳み状態に対応する全体的なタンパク質シグナルと、温度または化学分子のいずれかの変性剤の可変値を関連付ける方程式が導出されています。これらの方程式は、複雑なタンパク質の安定性を測定し、野生型と変異タンパク質の安定性を比較するための強力な理論的基礎を提供します。^[7]このような方程式は、数学的制限（アベル・ルフィニの定理）のため、より高次のオリゴマーの五量体に対しては導出できません。

• Pace CN. (1975)「球状タンパク質の安定性」、CRC Critical Reviews in Biochemistry、1-43。
• Santoro MM および Bolen DW. (1988)「線形外挿法による展開自由エネルギー変化の測定。1. 異なる変性剤を使用したフェニルメタンスルホニル α-キモトリプシンの展開」、生化学、27、8063–8068。
• Privalov PL. (1992)「タンパク質の折り畳まれた構造の安定性の物理的根拠」、T.E.Creighton 編、WH.Freeman、pp.83-126。
• Yao M および Bolen DW. (1995)「変性剤誘導性変性自由エネルギー測定はどの程度有効か? リボヌクレアーゼ A 安定性の拡張範囲における一般的な仮定への適合レベル」、生化学、34、3771–3781。
• Jackson SE. (1998)「小さな単一ドメインタンパク質はどのように折り畳まれるか？」Folding & Design、3、R81-R91。
• Schwehm JM および Stites WE. (1998)「タンパク質の立体配座安定性の決定のための自動化方法の応用」、Methods in Enzymology、295、150–170。