ダウンヒルフォールディング

ダウンヒルフォールディングは、タンパク質が大きな巨視的自由エネルギー障壁に遭遇することなく折り畳まれるプロセスです。これは、タンパク質のエネルギーランドスケープ理論のフォールディングファンネル仮説の重要な予測です。

ダウンヒルフォールディングは、極端なネイティブバイアスの条件、つまり低温または変性剤の不在下で発生すると予測されています。これは、エネルギーランドスケープ理論のタイプ 0シナリオ^{[説明が必要]に対応します。見かけの}中間点に近い温度または変性剤濃度では、タンパク質はダウンヒルフォールディングから 2 状態フォールディング、つまりタイプ 0からタイプ 1への遷移に切り替わる可能性があります。

グローバル ダウンヒル フォールディング (または1 状態フォールディング) は、あらゆる条件下で自由エネルギー障壁が存在しない状態でタンパク質がフォールディングされる別のシナリオです。言い換えると、あらゆる温度と変性剤濃度で単峰性の集団分布があり、異なる条件で異なる構造の集合が出現する連続的な展開遷移を示唆しています。これは、2 つの集合 (フォールディングされた状態と展開された状態) と急激な展開遷移のみを想定する 2 状態フォールディングとは対照的です。

タンパク質の折り畳みにおける自由エネルギー障壁は、大きなエネルギー項とエントロピー項の間の補償の結果として生じるため、小さいと予測されます。安定化エネルギーの増加とコンフォメーションエントロピーの損失が同期していない場合は、2 状態折り畳みが発生しますが、折り畳みが進むにつれてこれら 2 つの項が同期すると、ダウンヒル折り畳みが発生します。

2状態フォールディングにおける遷移状態構造は実験的にアクセスできない（定義により、反応座標に沿って最も人口が少ない）が、ダウンヒルフォールディングプロセスにおけるフォールディングサブアンサンブルは、分光法によって理論的に区別可能である。^{[1] [2]}大腸菌 の2-オキソグルタル酸脱水素酵素多酵素複合体のE2サブユニットからの独立したフォールディングドメインである40残基タンパク質BBLは、全体的にダウンヒルにフォールディングすることが実験的に示されている。^{[3] [4]}また、ラムダリプレ​​ッサータンパク質の変異体は、温度/溶媒条件を変更するとダウンヒルから2状態に移行することが示されている。しかし、ダウンヒルフォールディングタンパク質としてのBBLの状態、ひいては天然に存在するダウンヒルフォルダーの存在は、議論の的となっている。^{[5] [6] [7]}現在の論争は、タンパク質を2状態またはダウンヒルとして分類できる唯一の方法が、これらの2つの状況を明示的に扱うモデル、つまり障壁の高さが変化することを許容するモデルを使用して実験データを分析することであるという事実から生じています。残念ながら、これまでの実験データのほとんどは、単純な化学的2状態モデルを使用して分析されています。言い換えれば、かなり大きな自由エネルギー障壁の存在が事前に想定されており、ダウンヒルまたは全体的にダウンヒルなタンパク質フォールディングを特定する可能性を排除しています。これは、協同性の程度に関係なく、任意のシグモイドアンフォールディング曲線を2状態モデルに適合させることができるため重要です。速度論的には、障壁の存在は単一指数関数を保証しますが、その逆は当てはまりません。^{[8]ただし、}酵母ホスホグリセリン酸キナーゼや変異ヒトユビキチンなどの一部のタンパク質では、ダウンヒルフォールディングを示唆する非指数関数的な速度論が観察されています。^[9]

これらの問題に対する提案された解決策は、さまざまな状況を区別し、ダウンヒルフォールディングタンパク質を識別するためのシンプルだが堅牢な実験基準を特定できるモデルを開発することです。これらは以下に概説されています。

^{タンパク質フォールディングの Zwanzig モデル[10]}の拡張に基づく分析によると、全体的なダウンヒルフォールディングタンパク質は、異なる技術で監視した場合、異なる見かけの融点(Tms) を示すはずです。 ^[2]これは、上記のタンパク質 BBL で実験的に確認されました。展開に続いて示差走査熱量測定(DSC)、円二色性(CD)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光を測定したところ、すべて異なる見かけの融点が示されました。^[3] CD 実験では、波長に依存する融点も観察されました。構造ベースの統計力学モデルで分析したデータの結果、すべての温度で単峰性の集団分布が得られ、構造的に分離した連続的な展開プロセスが示されました。このような実験で重要な問題は、構造のさまざまな側面を監視するプローブを使用することです。たとえば、DSC は展開に関連する熱容量の変化 (したがってエンタルピー) に関する情報を提供し、蛍光は蛍光体の直接の環境に関する情報、FRET は分子の平均寸法に関する情報、CD は二次構造に関する情報を提供します。

より厳密なテストには、分子内の各原子の化学シフトを核磁気共鳴（NMR）で温度/変性剤の関数として追跡することが含まれます。この方法は時間がかかりますが、データの解釈に特定のモデルは必要ありません。タンパク質が2状態で折りたたまれる場合、すべての原子のTmは実験誤差内で同一になるはずです。しかし、全体的に下り坂に折りたたまれるタンパク質の場合、展開曲線のTmは大きく異なるはずです。BBLの原子展開挙動は後者に従うことがわかり、全体的な下り坂の挙動と一致するTmの大きな広がりを示しました。^[4]一部の原子のTmは全体的なTm（CDや蛍光などの低解像度技術から取得）と類似していることがわかりました。これは、このような実験で頻繁に行われる少数の原子ではなく、複数の原子の展開を追跡する必要があることを示しています。平均的な原子の展開挙動は CD のものと驚くほど類似しており、低解像度実験の展開曲線はより複雑な挙動を非常に単純化した表現であるという事実を強調しています。

2 状態フィッティングで頻繁に使用されるベースラインは、折り畳まれたウェルまたは折り畳まれていないウェルの変動に対応しています。折り畳まれた状態または折り畳まれていない状態の特性が温度/化学変性剤によってどのように変化するかについての情報がほとんどまたは全くないため、これらは純粋に経験的です。熱容量の変化はタンパク質アンサンブルの変動と、折り畳み解除時の疎水性残基の露出の両方に対応するため、これは DSC 実験の場合にさらに重要になります。多くの小さな高速折り畳みタンパク質の DSC プロファイルは幅広く、遷移前の傾斜が急です。これらのプロファイルへの 2 状態フィッティングでは、ベースラインが交差し、2 状態仮定がもはや有効ではないことが示されます。これは Munoz と Sanchez-Ruiz によって認識され、可変バリア モデルの開発につながりました。^{[11]彼らは、基礎となる}確率密度関数を 抽出するために DSC プロファイルのモデルフリー反転を試みる代わりに、1 つまたは 2 つの最小値を持つ特定の自由エネルギー関数 (相転移のLandau 理論に類似) を仮定し、自由エネルギー障壁の高さを抽出できるようにしました。このモデルは、平衡実験から障壁の高さを決定できる物理生化学で初めてのモデルです。このモデルを使用して BBL の DSC プロファイルを分析した結果、障壁の高さはゼロ、つまり下り坂の折り畳みとなり、統計力学モデルによる以前の結果が確認されました。可変障壁モデルを、速度と DSC データの両方が利用可能な一連のタンパク質に適用したところ、速度と障壁の高さの間に 0.95 という非常に高い相関が得られました。^[12]調べたタンパク質の多くは障壁が小さく (<20 kJ/mol)、1 ms より速く折り畳まれるタンパク質ではベースラインが交差していることが明らかでした。これは、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の間の自由エネルギー障壁が大きいという従来の仮定とは対照的です。

ダウンヒルフォールディングは実験的に測定するのが難しいため、分子動力学とモンテカルロシミュレーションが高速フォールディングタンパク質に対して実行され、フォールディングの速度論が調べられてきた。フォールディング速度がフォールディングの「速度限界」かそれに近いタンパク質は、そのタイムスケールによりフォールディングがシミュレーション手法にとってよりアクセスしやすいため、ダウンヒルフォールディングがより一般的に行われる可能性がある。^{[13] BBLタンパク質のシミュレーション研究は、その急速なフォールディング速度と非常に低いエネルギー障壁は、フォールディングプロセス中の}ネイティブコンタクトの形成における協同性の欠如、つまり低い接触秩序から生じることを示唆している。協同性の欠如と低い接触秩序の関係は、モンテカルロ格子シミュレーションのコンテキストでも観察された^{。[14]これらのデータは、タンパク質の}残基 あたりの「非局所的接触」の平均数が障壁の高さの指標として機能し、非常に低い非局所的接触値がダウンヒルフォールディングを意味することを示唆している。^[15] KnottとChanによる粗粒度シミュレーションも、BBLにおけるグローバルなダウンヒルフォールディングの実験的観察を裏付けている。^[16]より最近の研究では、一定pH分子動力学（CpHMD）シミュレーションを使用して、相反するダウンヒルフォールディングと2状態フォールディングのメカニズムを調和させ、フォールディング障壁が酸性pH条件で消失し、ダウンヒルフォールディングにつながることを発見しました。^[17]

• ビクター・ムニョス博士

• Bieri O、Kiefhaber T. (2000)。タンパク質フォールディングの運動モデル。タンパク質フォールディングのメカニズム第 2 版。RH Pain 編。分子生物学の最前線シリーズ。オックスフォード大学出版局: オックスフォード、英国。
• Gruebele M. (2008) 高速タンパク質フォールディング。Protein Folding, Misfolding and Aggregation Ed. V Muñoz。RSC Biomolecular Sciences シリーズ。Royal Society of Chemistry Publishing: Cambridge、英国。