高速並列タンパク質分解

高速並列プロテオリシス（FASTpp ）は、タンパク質のどの画分が急速なプロテオリシス消化に抵抗するかを測定することによって、タンパク質の熱安定性を決定する方法です。 ^{[ 1 ]}

タンパク質分解は、生化学や細胞生物学においてタンパク質の構造を調べるために広く用いられている。^{[ 2 ] [ 3 ]}「限定トリプシンタンパク質分解」では、少量のプロテアーゼが折り畳まれたタンパク質と折り畳まれていないタンパク質の両方を消化するが、その速度は大きく異なる。構造化されていないタンパク質はより速く切断されるのに対し、構造化されたタンパク質はより遅い速度で切断される（場合によっては桁違いに）。近年、折り畳まれていないタンパク質を切断する特異性の高い他のプロテアーゼを利用した、タンパク質分解に基づくタンパク質安定性の他のアッセイがいくつか提案されている。これらには、パルスタンパク質分解^{[ 4 ]} 、タンパク質分解走査熱量測定^{[ 5 ]}、およびFASTppが含まれる。

FASTppは、さまざまな条件下で消化に抵抗するタンパク質の量を測定します。この目的のために、露出した疎水性残基を特異的に切断する耐熱性プロテアーゼが使用されます。FASTppアッセイは、熱変性、変性した画分に対する耐熱性プロテアーゼの特異性、およびSDS-PAGEの分離能力を組み合わせています。^{[ 6 ]} この組み合わせにより、FASTppは、85 ℃までの温度、pH 6～9、全プロテオームの存在または非存在など、広範囲の物理化学的条件下で折り畳まれた画分の変化を検出できます。用途は、バイオテクノロジーから点変異の研究、リガンド結合アッセイまで多岐にわたります。

FASTpp は、以下の調査に使用されています。^{[ 1 ]}

• タンパク質の安定性に対する溶解液の影響
• 熱プロテオーム安定性^{[ 7 ]}
• 結合された折り畳みと結合^{[ 8 ]}
• リガンドが折り畳まれた割合と安定性に及ぼす影響^{[ 9 ]}
• 変異が折り畳まれた割合と安定性に及ぼす影響（例：点変異／ミスセンス変異^{[ 9 ] [ 10 ]}）
• タンパク質の動的安定性^{[ 11 ]}

まず、ガラスビーズ破砕、加圧ホモジナイゼーション、または目的のタンパク質を変性させない化学的もしくは物理的溶解法によって細胞溶解液が生成されます。（オプションで、標的分析の場合）この溶解液から、内在的に無秩序なタグ^{[ 12 ]}に基づくアフィニティー法、または多くの場合、複数の直交クロマトグラフィー工程を含むその他の適切な精製戦略によって、目的のタンパク質が精製されます。

この（全または精製された）タンパク質溶液は、PCRストリップの複数のチューブに分注されます。すべての分注液は、耐熱性プロテアーゼであるサーモリシンの存在下で、熱勾配PCRサイクラー内で異なる最高温度に並行して曝露されます（図を参照）。自動温度制御は、熱勾配サイクラー（PCRによく使用される）で行われます。反応生成物は、SDS-PAGEまたはウェスタンブロットによって分離できます。^{[ 6 ]} プロテアーゼであるサーモリシンは、EDTAによって完全に不活性化できます。サーモリシンのこの特性により、FASTppは、質量分析などの後続のトリプシン消化と互換性があります。^{[ 13 ] [ 14 ] [ 7 ]}