ファイ値分析

ファイ値解析、解析、または-値解析は、2 つの状態で折りたたまれる小さなタンパク質ドメインの折りたたみ遷移状態の構造を研究するための実験的なタンパク質工学技術です。折りたたみ遷移状態は定義上、可動性があり部分的に構造化されていないため、タンパク質 NMRやX 線結晶構造解析などの方法で折りたたみ遷移状態の構造を見つけることは困難です。 -値解析では、野生型タンパク質の折りたたみ速度と立体配座折りたたみ安定性を点変異体のものと比較して、ファイ値を見つけます。これらは、折りたたみ遷移状態への変異残基のエネルギー的寄与を測定します。これにより、野生型および変異タンパク質の折りたたまれていない状態、折りたたまれた状態、および遷移状態の 相対的な自由エネルギーを考慮することで、遷移状態における変異残基の周囲の天然構造の程度が明らかになります。${\displaystyle \phi}$ ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

タンパク質の残基は、折り畳まれた遷移状態で整然とした残基クラスターを識別するために、1つずつ変異される。これらの残基の相互作用は、単一部位変異体の効果を二重変異体の効果と比較する二重変異サイクル${\displaystyle \phi}$ 解析によって確認できる。ほとんどの変異は保存的であり、元の残基をアラニンなどのより小さな残基（空洞形成変異）に置き換えるが、チロシンからフェニルアラニン、イソロイシンからバリン、およびスレオニンからセリンへの変異体も使用できる。キモトリプシン阻害剤、SH3ドメイン、WWドメイン、タンパク質LおよびGの個々のドメイン、ユビキチン、およびバルナーゼはすべて、解析によって研究されている。 ${\displaystyle \phi}$

ファイは次のように定義される: ^[1]

$${\displaystyle \phi ={\frac {(\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D})}{(\Delta G_{W}^{ N\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{N\rightarrow D})}}={\frac {\Delta \Delta G^{TS\rightarrow D}}{\デルタ \デルタ G^{N\rightarrow D}}}}$$

${\displaystyle \Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}}$は、野生型タンパク質の遷移状態と変性状態の間のエネルギー差であり、は変異タンパク質の同じエネルギー差であり、ビットは天然状態と変性状態の間のエネルギー差です。 ファイ値は、変異が遷移状態を折り畳まれた状態と比較してどれだけ不安定にするかとして解釈されます。 ${\displaystyle \Delta G_{M}^{TS\rightarrow D}}$${\displaystyle \Delta G^{N\rightarrow D}}$

0 から 1 の範囲を意図していたかもしれませんが、負の値が表示されることもあります。 ^[2] 0 の値は、変異がフォールディング経路の律速遷移状態の構造に影響を与えないことを示し、1 の値は、変異がフォールディングされた状態と同じくらい遷移状態を不安定化させることを示します。0 に近い値は、変異の周囲の領域が遷移状態で比較的折り畳まれていないか構造化されていないことを示し、1 に近い値は、変異部位に近い遷移状態のローカル構造がネイティブ状態と似ていることを示します。タンパク質の表面での保守的な置換は、多くの場合、1 に近い phi 値を示します。が0 と 1 の間にある場合、どちらが当てはまるかがわからないため、あまり有益ではありません。 ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

1. 遷移状態自体が部分的に構造化されている、または
2. ほぼ同数の2 つのタンパク質集団があり、1 つはほとんど折り畳まれていない種類で、もう 1 つはほとんど折り畳まれています。

1. ファイ値解析は、エネルギーと化学構造が相関しているというハモンドの公理を前提としています。エネルギーランドスケープに明確に定義された深い全体的最小値がある場合、折り畳み中間体と天然状態の構造の関係は、それらのエネルギー間の関係と相関する可能性がありますが、エネルギーランドスケープが平坦であるか、多くの局所的最小値がある場合、自由エネルギーの不安定化は有用な構造情報を提供しない可能性があります。
2. ファイ値分析では、折り畳みエネルギーは変化する可能性があるものの、折り畳み経路は大きく変化していないと想定しています。非保守的な変異ではこれが証明されない可能性があるため、検出が困難な小さなエネルギー不安定化をもたらす可能性がある保守的な置換が好まれます。
3. ゼロより大きい数値に制限することは、突然変異によって安定性が高まり、ネイティブ状態と遷移状態のどちらのエネルギーも低下しないと仮定することと同じです。折り畳み遷移状態を安定させる相互作用はネイティブ構造の相互作用と似ていると仮定するのと同じですが、一部のタンパク質折り畳み研究では、遷移状態で非ネイティブ相互作用を安定させることで折り畳みが促進されることがわかっています。^[3]${\displaystyle \phi}$

アラン・ファーシュトは、細菌の小さなタンパク質であるバルナーゼの研究でファイ値解析の先駆者となった。^{[4] [5]}分子動力学シミュレーションを使用して、彼は折り畳みと展開の間の遷移状態が天然の状態に似ており、反応の方向に関係なく同じであることを発見した。ファイは変異の位置によって変化し、ある領域は0に近い値を示し、他の領域は1に近い値を示した。タンパク質の配列全体の値の分布は、シミュレートされた遷移状態のすべてと一致したが、1つのヘリックスだけが半独立して折り畳まれ、遷移状態が完全に形成された後にのみタンパク質の残りの部分と天然のような接触をした。1つのタンパク質の折り畳み速度のこのような変化は、値を解釈することを困難にする。そうでなければ、遷移状態の構造を計算コストの高い折り畳み-展開シミュレーションと比較しなければならないからである。 ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

折り畳み遷移状態を研究するための他の「運動学的摂動」技術が最近登場した。最もよく知られているのは psi ( ) 値^{[6] [7]である。これは、}ヒスチジンのような金属結合アミノ酸残基を 2 つタンパク質に組み入れ、金属イオン濃度の関数として折り畳み速度を記録することによって求められるが^[8]、 Fersht はこのアプローチは難しいと考えていた。^[9] -値の「架橋」バリアントは、ジスルフィド結合のような共有結合架橋が導入された折り畳み遷移状態におけるセグメントの関連性を研究するために使用された。 ^[10] -T 値分析は、温度の関数として変異体の応答を測定し、遷移状態の自由エネルギーへのエンタルピーとエントロピーの寄与を分離するために -値分析の拡張として使用されている。^[11]${\displaystyle \psi}$${\displaystyle \phi}$ ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

平衡安定性と水性（アン）フォールディング速度の測定における誤差は、変性剤を含む溶液の値をほぼ純粋な水溶液に外挿しなければならない場合や、天然タンパク質と変異タンパク質の安定性の差が「低い」、つまり 7 kJ/mol 未満の場合に大きくなる可能性があります。これにより、が0 ～ 1 の範囲を超える可能性があります。^[12]計算値は、利用可能なデータ ポイントの数に大きく依存します。^[13]残基あたり最大 4 つの変異を持つ WW ドメインの 78 個の変異体の研究では、どのような種類の変異が天然状態の柔軟性、溶媒和、およびその他の影響による干渉を回避するかを定量化しており、統計分析では、大規模な変異体スクリーニングから遷移状態の摂動に関する信頼性の高い情報が得られることが示されています。^[14]${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

• シェブロンプロット
• 変性中間点
• 均衡の展開