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ストップドフロー法は、溶液中の反応速度論を研究するための方法の一つです。典型的なデッドタイムが1ミリ秒程度の化学反応の研究に最適です。この手法の最も単純な形式では、2種類の反応物の溶液を混合チャンバーに通して急速に混合し、混合液がチャンバーから出てきたら光学観察セルを通過します。ある時点で流れを突然停止し、吸光度、蛍光、蛍光偏光などの適切な分光プローブを用いて反応を監視します。時間経過に伴う分光信号の変化を記録し、適切なモデルを用いてデータをフィッティングすることで、反応速度論を定義する速度定数を得ることができます。
ストップドフロー法は、実験手法としてブリットン・チャンス[ 1 ] [ 2 ]によって導入され、クエンティン・ギブソン[ 3 ]によって拡張されました。温度ジャンプ法などの他の手法は、より高速なプロセスに利用できます。
ストップドフロー分光法は、半減期がミリ秒単位の高速反応における化学反応速度論を溶液中で研究することを可能にする。当初は主に酵素触媒反応の研究に用いられていたが、その後、生化学、生物物理学、化学の研究室において、高速な化学反応を追跡するための主要な手法として急速に普及した。
最もシンプルな形態では、ストップドフローシステムは2つの溶液を迅速に混合します。各溶液の少量ずつが高効率ミキサーに送り込まれ、高速反応が開始されます。混合された溶液は観察セルに流れ込み、前回の実験や洗浄工程で残った内容物を押し出します。溶液が混合点から観察点まで移動するのにかかる時間は「デッドタイム」と呼ばれます。最小注入量は混合セルのサイズによって異なります。
十分な量の溶液が注入され、前の溶液が完全に置き換えられると、システムは定常状態に達し、流れが停止します。これは、ストップシリンジとハードストップアセンブリを使用して実現できます。この時点で、装置は検出器に「開始信号」、つまりトリガーを送信し、反応を観察できるようにします。トリガーのタイミングはソフトウェアで制御され、ユーザーは流れの停止と同期させることも、定常状態に達したことを確認するために少し早めにトリガーを送信することもできます。
ストップドフロー装置の性能は、デッドタイムによって大きく左右されます。デッドタイムとは、反応物が混合されてから観察が開始されるまでの時間であり、反応混合物が観察セルに入る時点での反応の経過時間に相当します。特定のストップドフロー装置のデッドタイムを制限する要因は、ミキサーの効率、ミキサーとセル間の距離、および流量が停止した瞬間の反応混合物の流量です。使用する観察セルの寸法にもよりますが、最新のストップドフロー装置は通常、0.5～1ミリ秒のデッドタイムを実現できます。
ストップドフロー装置の最もシンプルな動作モードは、単一混合構成です。2種類の反応物が使用され、これらはシリンジに充填され、空気圧制御ラムの作用によってシリンジのプランジャーが駆動され、ミキサーと光学セルを通過します。光学セルから出てきた反応混合物は3番目の（ストップ）シリンジに入り、ストップシリンジのプランジャーがトリガースイッチに接触すると流れが停止します。これにより、流れが停止すると同時にデータ収集が開始されます。
通常、混合比1:1を実現するために、2本の駆動シリンジは同じサイズですが、異なるサイズのシリンジを組み合わせることで、最大1:10または1:20までの混合比を実現できます。このいわゆる非対称混合、または比率混合は、ストップドフロー作業においてよく求められる要件です。
逐次混合、または二重混合は、ストップドフロー法の一種で、2種類の反応物をプレミキサーを通して熟成ループに送り込む。所定の遅延時間の後、混合された流体は別のミキサーを通して3種類目の反応物とともに送り込まれ、その後の反応は単一混合と同様に研究される。逐次混合は、反応中間体や短寿命の過渡現象の挙動を調べるために用いられる。
オゾンを発生しないキセノンアークランプは、250 nm以上の波長域における一般的なストップドフロー実験で広く用いられています。広帯域スペクトルのキセノンランプは非常に汎用性が高く、吸光度や蛍光測定においてほぼあらゆる波長を選択できるため、タンパク質の構造変化を経時的にモニタリングするなどの用途に最適です。
遠紫外線領域での用途には、オゾン発生型のキセノンアークランプが利用可能ですが、オゾンの蓄積と光学的劣化を防ぐために、純窒素ガスによるパージが必要です。一方、水銀キセノン（Hg-Xe）ランプは、目的とする励起波長が水銀の強い発光線のいずれかに対応する蛍光実験に適しています。
LED光源は、特に単一または少数の特定の波長のみが必要な場合、ストップドフロー実験において人気があり安価な選択肢の一つです。
2本のシリンジには、混合されるまで不活性な溶液が充填されています。これらの駆動シリンジは連結され、単一の駆動ラム（ピストン）または独立したステッピングモーターによって、混合装置に同時に排出されます。容量の異なるシリンジを使用することで、混合比率を容易に制御でき、混合溶液の比率を正確に調整できます。2つの試薬をプレインキュベートしてから3つ目の試薬を導入するなど、連続混合が必要な用途では、2つの独立した駆動ラムを使用することで、より複雑な混合シーケンスを実現できます。
2種類の溶液がシリンジから吐出されると、徹底的な混合を確実にするために設計された混合システム（通常はT字型ミキサーのような形状）に入ります。この構成により乱流が発生し、完全な混合が実現します。一方、層流では溶液が横並びで流れるため、混合が不完全になります。
デッドタイムとは、溶液が混合点から観測点まで移動するのに要する時間間隔であり、反応速度論のうち観測できない部分を表します。デッドタイムが短いほど装置の性能が向上し、より広範囲の反応の研究が可能になります。一般的なデッドタイムは、装置の設計によって0.5～1ミリ秒の範囲です。[ 4 ]
フローセルの寸法を小さくすることでデッドタイムを最小限に抑えることができますが、この方法は、観察ウィンドウが小さくなり、光路長が短くなることで信号対雑音比が低下するという制約があります。Peterman によって説明されている N-アセチルトリプトファンアミド (NAT) とN-ブロモスクシンイミド(NBS) の間の蛍光消光反応は、ストップドフロー装置のデッドタイムを測定するためによく使用される方法です。[ 5 ]
混合反応物は観察セル（フローセル）に送られ、そこで反応は分光光度計を用いてモニタリングされる。通常、吸光度、蛍光、蛍光異方性、円偏光二色性などの手法が用いられる。より包括的な分析のために、これらの手法のいくつかを組み合わせることがますます一般的になっている。[ 6 ]
フローセルカートリッジは、一般的に吸光光路長が1～10mm、蛍光光路長が約2mmのものが市販されている。蛍光測定においては、内部フィルター効果を最小限に抑えるため、短い光路長が特に重要となる。最新のストップドフロー装置は、様々な実験ニーズに対応できるよう、多様なフローセルサイズに対応できるように設計されている。
観察セル内の以前の内容物を完全に置き換えるのに十分な量の溶液が注入されると、混合液はストップシリンジと呼ばれる3番目のシリンジに流れ込みます。このシリンジは、容量校正済みのハードストップ機構に当たり、流れを停止させてシステムを定常状態にします。この時点で、検出器が作動し、反応の観察が開始されます。
ストップドフロー分光光度計は単体機器としても機能しますが、円偏光二色性（CD）、吸光度、および／または蛍光測定システムに組み込まれたり、特殊な用途をサポートするさまざまなアクセサリが装備されたりすることがよく行われます。一般的なストップドフロー用アクセサリには以下のようなものがあります。
その他の人気のある追加オプションやアクセサリーには、以下のようなものがあります。
これらのアクセサリと構成により、ストップドフロー分光光度計の汎用性が向上し、生化学、生物物理学、化学における幅広い用途での使用が可能になります。
ストップドフロー法は、ハミルトン・ハートリッジとフランシス・ロートン[ 7 ]がヘモグロビンへの酸素結合を研究するために開発した連続フロー法から発展したものである。連続フローシステムでは、反応混合物は長いチューブを通って観察システム（1923年当時は単純な比色計）を通過し、その後廃棄物として捨てられた。ハートリッジとロートンは、比色計をチューブに沿って移動させ、流量を知ることで、特定の時間間隔で反応の進行状況を測定することができた。
この技術革新は当時としては画期的なものであり、測定に数秒を要する従来の装置の制約にもかかわらず、比較的シンプルな装置を用いてミリ秒単位で起こるプロセスを研究できることを実証しました。しかし、この方法には実用上の大きな制約があり、特に大量の反応物が必要となるため、ヘモグロビンなどの豊富なタンパク質の研究に主に適していました。今日では、連続フロー法は実用的な目的においては時代遅れとみなされており、ストップドフロー分光法のような、より効率的で汎用性の高い技術に取って代わられています。
ストップドフロー法は、反応をリアルタイムで監視するために分光学的特性の存在に依存しています。そのような特性が利用できない場合、クエンチフロー法は従来の化学分析を使用することで代替手段を提供します。[ 8 ]機械的な停止システムの代わりに、反応はクエンチングによって停止されます。クエンチングでは、生成物は凍結、化学的変性、または変性光源への曝露によって直ちに停止されます。連続フロー法と同様に、混合とクエンチングの間の時間は、反応チューブの長さを変えることによって調整できます。
アラン・ファーシュトとロス・ジェイクスによって導入されたパルスクエンチフロー法[ 9 ]は、長い反応チューブを必要としません。この方法では、反応はストップドフロー実験と同様に開始されますが、クエンチングは3番目のシリンジを使用して行われ、開始後、あらかじめ設定された正確な時間にクエンチング剤が供給されます。
急冷フローは、停止フローと比較して明確な利点と欠点があります。利点としては、化学分析によって測定されたプロセスが明確に特定されるのに対し、停止フロー実験の分光信号は曖昧になる場合があることです。しかし、急冷フローは各時点を個別に測定する必要があるため、はるかに手間がかかります。たとえば、Klebsiella pneumoniaeの窒素固定酵素触媒の研究[ 10 ]では、半減期の一致により、420 nm での吸光度がPi放出に対応することが示されましたが、この結果を急冷フローで得るには 11 個の個別のデータポイントが必要であり、この方法の要求の厳しさが浮き彫りになりました。
ストップドフローは、生物システムの動力学を研究するために使用される複数の生物物理学的技術の 1 つにすぎません。より広い視点から、Zheng ら (2015)は、ストップドフロー分析、表面プラズモン共鳴分光法、アフィニティークロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動など、生物学的相互作用を調査するためのさまざまな分析方法を概説しています。この記事では、各技術の原理、応用、利点、および限界の概要が提供されています。[ 11 ]