マイクロサテライト

昆虫からヒトまで、多くの生物でマイクロサテライト突然変異率の直接推定が行われています。サバクトビバッタSchistocerca gregariaでは、マイクロサテライト突然変異率は、 1 世代あたり 1 遺伝子座あたり 2.1  × 10 ⁻⁴と推定されています。 ^{[ 27 ]}ヒトの男性生殖細胞系列におけるマイクロサテライト突然変異率は、女性生殖細胞系列の 5 ～ 6 倍高く、1 世代あたり配偶子あたり 1 遺伝子座あたり 0 ～ 7  × 10 ⁻³の範囲です。^{[ 1 ]}線虫Pristionchus pacificusでは、推定マイクロサテライト突然変異率は、1 世代あたり 1 遺伝子座あたり 8.9  × 10 ⁻⁵～ 7.5  × 10 ⁻⁴の範囲です。^{[ 28 ]}

マイクロサテライトの突然変異率は、マイクロサテライトに対する塩基の位置、反復タイプ、および塩基の同一性によって変化する。^{[ 26 ]}突然変異率は反復回数とともに上昇し、6～8回の反復でピークに達した後、再び減少する。^{[ 26 ]}集団におけるヘテロ接合性の増加もマイクロサテライトの突然変異率を増加させるが、^{[ 29 ]}特にアレル間の長さの差が大きい場合に顕著である。これは、腕の長さが異なる相同染色体が減数分裂中に不安定性を引き起こすためと考えられる。^{[ 30 ]}

哺乳類では、タンパク質の 20〜40% は、短い配列の繰り返しによってコードされるアミノ酸の繰り返し配列を含んでいます。 ^{[ 32 ]}ゲノムのタンパク質コード領域内の短い配列の繰り返しのほとんどは、3 つのヌクレオチドの繰り返し単位を持っています。これは、その長さでは突然変異時にフレームシフトが起こらないためです。^{[ 33 ]}各 3 つのヌクレオチドの繰り返し配列は、同じアミノ酸の繰り返しシリーズに転写されます。酵母では、最も一般的な繰り返しアミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、およびセリンです。

これらの繰り返しセグメントの変異は、タンパク質の物理的および化学的特性に影響を与え、タンパク質の作用に段階的かつ予測可能な変化をもたらす可能性があります。^{[ 34 ]}例えば、Runx2遺伝子のタンデム繰り返し領域の長さの変化は、飼い犬 ( Canis familiaris ) の顔の長さの違いにつながり、配列の長さが長いほど顔が長くなるという関連性があります。^{[ 35 ]}この関連性は、より広範囲の食肉目種にも当てはまります。^{[ 36 ]} HOXA13遺伝子内のポリアラニン配列の長さの変化は、ヒトの発達障害である手足性器症候群に関連しています。^{[ 37 ]}他のトリプレット繰り返しの長さの変化は、脆弱 X 症候群やハンチントン病などのトリヌクレオチド繰り返し疾患など、ヒトの 40 を超える神経疾患に関連しています。^{[ 10 ]}複製スリップによる進化的変化は、より単純な生物でも発生します。例えば、酵母の表面膜タンパク質ではマイクロサテライトの長さの変化がよく見られ、細胞特性の急速な進化をもたらしている。^{[ 38 ]}具体的には、FLO1遺伝子の長さの変化が基質への接着レベルを制御している。^{[ 39 ]}短い配列リピートは、病原性細菌の表面タンパク質にも急速な進化をもたらし、宿主の免疫学的変化に追いつくことを可能にする。^{[ 40 ]}真菌（ Neurospora crassa ）の短い配列リピートの長さの変化は、その概日時計サイクルの持続時間を制御している。^{[ 41 ]}

プロモーターやその他のシス調節領域内のマイクロサテライトの長さの変化は、世代間で遺伝子発現を急速に変化させる可能性がある。ヒトゲノムには、調節領域に多数の（16,000を超える）短い配列反復が含まれており、多くの遺伝子の発現に対する「調整ノブ」を提供している。^{[ 31 ] [ 42 ]}

細菌のSSRの長さの変化は、プロモーター間隔を変化させることで、インフルエンザ菌の線毛形成に影響を与える可能性がある。 ^{[ 40 ]}ジヌクレオチドマイクロサテライトは、ヒトゲノムのシス調節制御領域の豊富な変異と関連している。^{[ 42 ]}ハタネズミのバソプレシン1a受容体遺伝子の制御領域のマイクロサテライトは、その社会的行動と一夫一妻制のレベルに影響を与える。^{[ 43 ]}

ユーイング肉腫（若年者に発症する痛みを伴う骨癌の一種）では、点突然変異によってGGAAマイクロサテライト配列が伸長し、それが転写因子と結合して、癌を進行させるEGR2遺伝子を活性化します。 ^{[ 44 ]}さらに、他のGGAAマイクロサテライト配列も、ユーイング肉腫患者の臨床転帰に寄与する遺伝子の発現に影響を与える可能性があります。^{[ 45 ]}

イントロン内のマイクロサテライトも、現在理解されていないメカニズムを介して表現型に影響を与えます。たとえば、X25 遺伝子の最初のイントロンの GAA トリプレットの拡張は転写を妨害し、フリードライヒ運動失調症を引き起こすようです。^{[ 46 ]}アスパラギン合成酵素遺伝子の最初のイントロンのタンデムリピートは、急性リンパ芽球性白血病と関連しています。^{[ 47 ]} NOS3 遺伝子の第 4 イントロンのリピート多型は、チュニジア人集団の高血圧と関連しています。^{[ 48 ]} EGFR 遺伝子のリピート長の短縮は、骨肉腫と関連しています。^{[ 49 ]}

ゼブラフィッシュに保存されている古代型のスプライシングでは、U2AF2や他のスプライシング機構が存在しない場合でも、イントロンmRNA内のマイクロサテライト配列を使用してイントロンを除去することが知られています。これらの配列は、3'と5'のイントロンスプライス部位を近接させる非常に安定したクローバーリーフ構造を形成し、スプライソソームを効果的に置き換えると考えられています。このRNAスプライシング方法は、四足動物の形成時にヒトの進化から分岐し、 RNAワールドのアーティファクトであると考えられています。^{[ 50 ]}

ヒトゲノムのほぼ50%は、様々な種類の転移因子（トランスポゾン、または「ジャンプ遺伝子」とも呼ばれる）に含まれており、その多くは反復DNAを含んでいる。^{[ 51 ]}これらの場所にある短い配列の反復も遺伝子発現の調節に関与している可能性が高い。^{[ 52 ]}

複製制御が損なわれている腫瘍細胞では、有糸分裂の各ラウンド中にマイクロサテライトが特に高い頻度で獲得または喪失される可能性があります。したがって、腫瘍細胞株は宿主組織とは異なる遺伝子フィンガープリントを示す可能性があり、特に大腸癌ではヘテロ接合性の喪失を示す可能性があります。^{[ 53 ] [ 54 ]}そのため、原発組織で分析されたマイクロサテライトは、腫瘍の進行を評価するために癌の診断で日常的に使用されています。^{[ 55 ] [ 56 ] [ 57 ]}ゲノムワイド関連研究（GWAS）は、さまざまな癌における遺伝的素因の源としてマイクロサテライトバイオマーカーを特定するために使用されています。^{[ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]}

マイクロサテライト分析は1990年代に法医学の分野で普及しました。 ^{[ 61 ]}これは個人の遺伝子指紋鑑定に使用され、法医学的識別（通常は犯罪痕跡を被害者または加害者と照合する）を可能にします。また、骨髄移植患者の経過観察にも使用されます。^{[ 62 ]}

現在、法医学分析に使用されているマイクロサテライトはすべてテトラヌクレオチドまたはペンタヌクレオチドの繰り返し配列であり、これらはエラーのないデータの割合が高く、かつ理想的でない条件下での劣化に耐えられるほど短い。さらに短い繰り返し配列はPCRスタッターや優先増幅などのアーティファクトの影響を受けやすく、一方、長い繰り返し配列は環境劣化の影響をより強く受け、PCRによる増幅効率が低下する。^{[ 63 ]}もう一つの法医学的考慮事項は、個人の医療上のプライバシーを尊重する必要があるため、非コード領域であり、遺伝子調節に影響を与えず、通常はハンチントン病などのトリプレット拡張疾患に関与する可能性のあるトリヌクレオチドSTRではない法医学STRが選択されることである。法医学STRプロファイルは、英国国立DNAデータベース（NDNAD）、米国CODIS、オーストラリアNCIDDなどのDNAデータベースに保存されている。

常染色体マイクロサテライトは、血縁分析（最も一般的には父子鑑定）におけるDNAプロファイリングに広く使用されています。 ^{[ 64 ]}父方から受け継がれるY-STR（Y染色体上のマイクロサテライト）は、系図DNA検査でよく使用されます。

1990年代から2000年代初頭にかけて、マイクロサテライトは、サンプリングされた家系図の世代間の分離観察を利用して、特定の表現型や疾患の原因となる遺伝子を特定するためのゲノムワイドスキャンの主力遺伝子マーカーでした。高スループットで費用対効果の高い一塩基多型（SNP）プラットフォームの台頭により、ゲノムスキャンにSNPが用いられる時代になりましたが、マイクロサテライトは連鎖および関連研究において、ゲノム変異の非常に有益な指標であり続けています。その継続的な利点は、二対立遺伝子SNPよりも対立遺伝子の多様性が大きいことであり、そのためマイクロサテライトは、関心のあるSNPで定義された連鎖不平衡ブロック内の対立遺伝子を区別することができます。このように、マイクロサテライトは、2型糖尿病（TCF7L2）および前立腺癌遺伝子（8q21領域）の発見に成功しています。^{[ 6 ] [ 65 ]}

マイクロサテライトは、 PCRが研究室で広く普及したことで、研究者が低コストでプライマーを設計し、マイクロサテライトのセットを増幅できるようになったため、1990年代に集団遺伝学で普及しました。その用途は多岐にわたります。 ^{[ 67 ]}中立的な進化の歴史を持つマイクロサテライトは、ボトルネック^{[ 68 ]}、局所適応^{[ 69 ]} 、対立遺伝子固定指数（FST _） [70]、^{集団サイズ[} 71 ^{]、遺伝子}流動[ ^{72 ]の}測定や推測に利用できます。次世代シーケンシングがより手頃な価格になるにつれて、マイクロサテライトの使用は減少しましたが、この分野では依然として重要なツールです。^{[ 73 ]}

マーカー支援選抜（MAS）は、目的の形質そのものではなく、目的の形質（生産性、病害抵抗性、ストレス耐性、品質など）に関連するマーカー（形態学的、生化学的、またはDNA / RNA変異）に基づいて目的の形質を選択する間接的な選抜プロセスです。マイクロサテライトは、植物育種を支援するためのマーカーとして提案されています。^{[ 74 ]}

マイクロサテライトは、隣接領域の固有配列をプライマーとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プロセス によって増幅して識別することができます。DNAは高温で繰り返し変性されて二本鎖が分離され、その後冷却されてプライマーのアニーリングとマイクロサテライトを介したヌクレオチド配列の伸長が可能になります。このプロセスにより、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で目視できるほどの十分な量のDNAが生成されます。このようにサーマルサイクリングによって複製セグメントが指数関数的に増加するため、増幅には少量のDNAしか必要ありません。^{[ 83 ]} PCR技術が豊富にあるため、マイクロサテライト遺伝子座を挟むプライマーは簡単かつ迅速に使用できますが、正しく機能するプライマーの開発は、多くの場合、面倒で費用のかかるプロセスです。

ゲノムの特定領域、例えば特定のイントロン内でマイクロサテライトマーカーを探索する場合、プライマーは手動で設計できます。これには、ゲノムDNA配列からマイクロサテライト反復配列を探索する作業が含まれます。この探索は、目視で行うことも、リピートマスカーなどの自動ツールを使用することもできます。有用なマイクロサテライトが特定されたら、その隣接配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、PCR反応で特定のマイクロサテライト反復配列を増幅します。

ランダムマイクロサテライトプライマーは、対象種のランダムなDNA断片をクローニングすることによって開発できます。これらのランダムな断片は、プラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入され、それが大腸菌に移植されます。次にコロニーが発達し、DNA断片上にマイクロサテライト反復配列が存在する場合にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチド配列でスクリーニングされます。この手順で陽性クローンが得られた場合、DNAがシーケンスされ、特定の遺伝子座を決定するために、そのような領域を挟む配列からPCRプライマーが選択されます。このプロセスには、マイクロサテライト反復配列を予測する必要があり、ランダムに分離されたプライマーが有意な多型を示さない可能性があるため、研究者によるかなりの試行錯誤が必要です。^{[ 22 ] [ 84 ]}マイクロサテライト遺伝子座はゲノム全体に広く分布しており、PCRによる増幅に適した基質さえあればよいので、古い標本の半分解DNAから分離することができます。

より最近の技術では、マイクロサテライトの反復配列に相補的な反復配列からなるオリゴヌクレオチド配列を使用して、抽出したDNAを「濃縮」します（マイクロサテライト濃縮）。オリゴヌクレオチドプローブはマイクロサテライトの反復配列とハイブリダイズし、プローブ/マイクロサテライト複合体は溶液から引き出されます。濃縮されたDNAは通常どおりクローニングされますが、成功率ははるかに高くなり、使用領域の開発に必要な時間が大幅に短縮されます。ただし、どのプローブを使用するかは、それ自体が試行錯誤のプロセスになる可能性があります。^{[ 85 ]}

ISSR（インターシンプルシーケンスリピート）は、マイクロサテライト遺伝子座間のゲノム領域を表す一般的な用語です。隣接する2つのマイクロサテライトの相補配列をPCRプライマーとして使用し、それらの間の可変領域を増幅します。PCRにおける増幅サイクルの長さが制限されているため、過度に長い連続DNA配列の複製が防止され、結果として、一般的には短いものの、長さが大きく異なる様々な増幅DNA鎖の混合物が得られます。

ISSR-PCRで増幅された配列は、DNAフィンガープリンティングに利用できます。ISSRは保存領域または非保存領域である可能性があるため、この技術は個体識別には適していませんが、系統地理学的解析や種の境界設定には有効です。配列の多様性はSSR-PCRよりも低いものの、実際の遺伝子配列よりは高いです。さらに、マイクロサテライト配列決定とISSR配列決定は相互に補完し合う関係にあり、一方が他方のプライマーを生成します。

反復DNAは、ホモポリマー領域に苦戦する次世代DNAシーケンシング法では容易に解析できません。 ^{[ 86 ]}そのため、マイクロサテライトは通常、従来のPCR増幅とアンプリコンサイズの決定によって解析されます。PCRを使用するということは、マイクロサテライトの長さ解析は、他のPCR増幅DNA遺伝子座と同様にPCRの制限を受けやすいことを意味します。特に懸念されるのは、「ヌルアレル」の発生です。

• 父子鑑定のケースワークなどのサンプルにおいて、マイクロサテライトに隣接するDNAの突然変異によりPCRプライマーが結合してアンプリコンを生成できなくなる場合があり（ゲルアッセイで「ヌルアレル」が生成される）、その結果、一方のアレルのみが増幅され（変異していない姉妹染色体から）、個人が誤ってホモ接合体であるように見えることがあります。これは父子鑑定のケースワークで混乱を招く可能性があります。その場合、別のプライマーセットを使用してマイクロサテライトを増幅する必要があるかもしれません。^{[ 22 ] [ 87 ]}ヌルアレルは特に、伸長が始まる3'セクションでの突然変異によって引き起こされます。
• 例えば保全活動における種や集団の解析において、ある個体または種でマイクロサテライトを増幅するPCRプライマーは、他の種でも使用できる場合があります。しかし、異なる種間でPCRプライマーを適用する際のリスクは、配列の差異が大きすぎてプライマーが結合できない場合、ヌルアレルが生じる可能性が高くなることです。その結果、種の多様性が実際よりも低く見えることがあります。この場合、ヌルアレルは、ホモ接合体の頻度が過剰になることで示され、ハーディ・ワインベルグ平衡の期待値から逸脱することがあります。