概日時計

概日時計、または概日振動子は、体内時計としても知られ、安定した位相で循環し、太陽時間と同期する生化学的振動子です。

このような時計の生体内周期は必然的にほぼ正確に 24 時間 (地球の現在の太陽日) になります。ほとんどの生物では、内部で同期された概日時計により、生物は昼夜サイクルに対応する毎日の環境変化を予測し、それに応じて生物学的機能と行動を調整することができます。

概日リズムという用語はラテン語のcirca (約) dies (1 日) に由来しており、外部からの刺激 (環境光など) がなくなると、正確に 24 時間にならないことに由来しています。たとえば、常に低光量の実験室にいる人間の体内時計は、正確に 24 時間ではなく、1 日平均約 24.2 時間になります。^[1]

通常の体内時計は、正確に 24 時間の内因性周期で振動し、主に日光と暗闇などの環境から十分な毎日の修正信号を受け取ると、同調します。概日時計は、概日リズムを駆動する中心的なメカニズムです。概日時計は、3 つの主要な要素で構成されています。

• 約 24 時間の周期で時間を計る中心的な生化学振動子。
• 時計の同調を可能にするためのこの中心発振器への一連の入力経路。
• 生物全体の生化学、生理学、行動における明白なリズムを制御する発振器の異なる位相に結びついた一連の出力経路。

生物が環境からの光などの時間シグナルを感知すると、時計はリセットされます。概日時計は体の組織に遍在し、内因性シグナルと外因性シグナルの両方によって同期され、組織特有の方法で一日を通して転写活動を調節します。^[2]概日時計はほとんどの細胞代謝プロセスと絡み合っており、生物の老化の影響を受けます。^{[3]生物時計の基本的な分子メカニズムは、}脊椎動物、ショウジョウバエ、植物、真菌、細菌で定義されています。^{[4] [5]}また、おそらく古細菌でも定義されています。^{[6] [7] [8]}

2017年、ショウジョウバエにおける概日リズムを制御する分子メカニズムの発見により、ジェフリー・C・ホール、マイケル・ロスバッシュ、マイケル・W・ヤングの3名にノーベル生理学・医学賞が授与された。 ^[9]

脊椎動物では、マスター概日時計は、約20,000個のニューロンからなる両側の神経クラスターである視交叉上核（SCN）内にあります。 ^{[10] [11]} SCN自体は、視交叉の真上に位置する脳の小さな領域である視床下部にあり、網膜視床下部路を介して網膜の特殊な光感受性神経節細胞からの入力を受け取ります。

SCNは、独自のほぼ24時間のリズムを示し、局所組織の概日現象を制御する「スレーブ発振器」を同期させることによって、体全体の制御を維持します。^[12]血管作動性腸管ペプチドなどの細胞間シグナル伝達メカニズムを介して、SCNは他の視床下部核と松果体に信号を送り、体温とコルチゾールやメラトニンなどのホルモンの生成を調節します。これらのホルモンは循環系に入り、生物全体に時計駆動効果を引き起こします。

しかし、体全体の組織に含まれる多くの生化学的時計に主要な同調をもたらすシグナル (またはシグナル群) が正確には何であるかは明らかではありません。詳細については、以下の「概日振動子の調節」セクションを参照してください。

高等真核生物における概日リズムの遺伝的根拠の証拠は、1971年にロン・コノプカとシーモア・ベンザーが行った順方向遺伝子スクリーニングにより、ショウジョウバエのperiod（per）遺伝子座が発見されたことに始まる。 ^[13] per circadian変異体とショウジョウバエ時計遺伝子のさらなる変異の分析を通じて、転写と翻訳の正と負の自己調節フィードバックループを包含するモデルが提案された。コア概日「時計」遺伝子は、タンパク質産物が概日リズムの生成と調節に必要な要素である遺伝子として定義される。同様のモデルが哺乳類や他の生物でも提案されている。^{[14] [15]}

しかし、シアノバクテリアの研究によって、時計のメカニズムに対する私たちの見方は変わりました。近藤らは、これらの単細胞生物は転写がなくても正確な24時間のタイミングを維持できることを発見したからです。つまり、リズムのための転写-翻訳の自己調節フィードバックループは必要ないのです。^[16]さらに、この時計は試験管内で（つまり、細胞成分が存在しない状態で）再構築され、遺伝子フィードバック回路を必要とせずに正確な24時間時計を形成できることが証明されました。^[17]しかし、このメカニズムはシアノバクテリアにのみ適用可能であり、一般的には適用できませんでした。

2011年、ケンブリッジ大学のレディ研究室から理解の大きな進歩がありました。この研究グループは、核のない細胞、つまりヒトの赤血球の酸化還元タンパク質（ペルオキシレドキシン）に概日リズムを発見しました。 ^[18]これらの細胞には転写や遺伝子回路がなく、したがってフィードバックループもありませんでした。同様の観察が海藻で行われ^[19]、その後マウスの赤血球でも行われました。^[20]さらに重要なことに、ペルオキシレドキシンのリズムによって実証された酸化還元振動は、進化の樹形図をカバーする複数の遠い生命界（真核生物、細菌、古細菌）で現在確認されています。^{[6] [21]したがって、酸化還元時計は}祖父の時計であり、遺伝子フィードバック回路は細胞と組織の生理機能と行動を制御する主要な出力メカニズムであるように見えます。 ^{[22] [23]}

したがって、時計のモデルは、転写回路と、酸化還元振動やタンパク質リン酸化サイクルなどの非転写要素との相互作用の産物として考えなければならない。^{[24] [25]}

ヒトの概日時計の既知の構成要素の選択的遺伝子ノックダウンは、能動的な補償機構と冗長性の両方が時計の機能を維持するために使用されていることを示しています。^{[26] [27] [28] [29]} いくつかの哺乳類の時計遺伝子は、自然発生、化学的に誘導、標的ノックアウト変異を有する動物の実験や、さまざまな比較ゲノムアプローチを通じて特定され、特徴付けられています。^[26]

特定されている時計成分の大部分は、タンパク質の安定性と核への移行を調節し、2つの連動したフィードバックループを形成する転写活性化因子または抑制因子である。^[30]一次フィードバックループでは、基本ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）-PAS（Period-Arnt-Single-minded）転写因子ファミリーのメンバーであるCLOCKとBMAL1が細胞質内でヘテロ二量体化して複合体を形成し、核への移行後に、コア時計遺伝子「period」遺伝子（PER1、PER2、およびPER3）や2つのクリプトクロム遺伝子（CRY1とCRY2）などの標的遺伝子の転写を開始する。負のフィードバックは、PER:CRYヘテロ二量体が核に戻ってCLOCK:BMAL1複合体の活性を阻害することで自身の転写を抑制することによって達成される。^[5] CLOCK:BMAL1ヘテロ二量体がレチノイン酸関連オーファン核受容体であるRev-ErbAとRoraの転写を活性化すると、別の制御ループが誘導される。REV-ERBaとRORaはその後、Bmal1プロモーターに存在するレチノイド関連オーファン受容体応答要素（RORE）に結合するために競合する。その後のROREの結合を通じて、RORとREV-ERBのメンバーはBmal1を制御することができる。RORはBmal1の転写を活性化するが、REV-ERBは同じ転写プロセスを抑制している。したがって、 Bmal1の概日振動はRORとREV-ERBによって正と負の両方に制御されている。^[30]

D. melanogasterでは、遺伝子 cycle (CYC) は哺乳類の BMAL1 の相同遺伝子である。したがって、CLOCK–CYC 二量体は概日遺伝子の転写を活性化する。遺伝子 timeless (TIM) は、哺乳類 CRY の相同遺伝子であり、阻害剤として機能する。D . melanogaster CRY は、代わりに光受容体として機能する。ハエでは、CLK–CYC は転写時にのみ概日調節遺伝子のプロモーターに結合する。安定化ループも存在し、遺伝子 vrille (VRI) は阻害し、PAR ドメインタンパク質 1 (PDP1) は Clock 転写を活性化する。^[31]

糸状菌N. crassaの時計機構は哺乳類やハエのものと類似しているが、相同性はない。^[32]

植物の概日時計は、動物、真菌、細菌の時計とは全く異なる要素から成ります。植物時計は、一連の連動する転写フィードバックループから成り立つという点で、動物時計と概念的に類似しています。時計に関与する遺伝子は、一日の決まった時間に発現がピークになります。植物時計で最初に特定された遺伝子は、TOC1、CCA1、およびLHYでした。CCA1 および LHY 遺伝子の発現のピークは夜明けに起こり、TOC1 遺伝子の発現のピークは、おおよそ夕暮れ時に起こります。CCA1/LHY および TOC1 タンパク質は、互いの遺伝子の発現を抑制します。その結果、夜明け後に CCA1/LHYタンパク質レベルが減少し始めると、TOC1 遺伝子の抑制が解除され、TOC1 発現および TOC1 タンパク質レベルが増加します。TOC1 タンパク質レベルが増加すると、CCA1 および LHY 遺伝子の発現がさらに抑制されます。このシーケンスの逆のことが夜間に起こり、夜明けに CCA1 および LHY 遺伝子のピーク発現を再確立します。時計には、PRR 遺伝子、Evening Complex、光に敏感な GIGANTIA および ZEITLUPE タンパク質を 含む複数のループが組み込まれており、はるかに複雑です。

細菌の概日リズムでは、シアノバクテリアのKai Cタンパク質のリン酸化の振動が、KaiCをKaiA、KaiB、およびATPとともにインキュベートすることによって無細胞系（in vitro時計）で再構成されました。^[17]

長い間、概日時計を構成する転写調節因子によって駆動される転写活性化/抑制サイクルが、哺乳類における概日遺伝子発現の主な原動力であると考えられてきました。しかし、最近では、メッセンジャーRNAサイクリング遺伝子のわずか22％がde novo転写によって駆動されることが報告されました。^[33]その後、mRNAポリアデニル化ダイナミクスなど、リズミカルなタンパク質発現を駆動するRNAレベルの転写後メカニズムが報告されました。^[34]

フスティン^{[誰? ]}と同僚は、mRNA（特に時計転写産物自体）内の内部アデノシン（m ^{6 A）のメチル化が概日周期の重要な調節因子であることを特定した。細胞メチル化の薬理学的阻害、より具体的にはm 6} AメチラーゼMettl3のsiRNA媒介サイレンシングによるm 6 Aメチル化の阻害は、^概日周期の劇的な延長をもたらした。対照的に、試験管内でMettl3を過剰発現させると、周期は短くなった。これらの観察は、概日時計のRNAレベルの転写後調節の重要性を明確に実証し、同時に（m ⁶ A）RNAメチル化の生理学的役割を確立した。^[35]

時計の自己調節フィードバックループは、1周期を完了するのに約24時間かかり、概日分子時計を構成します。この約24時間の分子時計の生成は、リン酸化、SUMO化、ヒストンのアセチル化とメチル化、ユビキチン化などの翻訳後修飾によって制御されます。^[31]可逆的なリン酸化は、核への移行、タンパク質複合体の形成、タンパク質の分解などの重要なプロセスを制御します。これらの各プロセスは、約24時間の周期を維持することに大きく貢献し、前述のコア時計タンパク質の安定性に影響を与えることで概日時計の精度を高めます。したがって、転写制御がリズミカルなRNAレベルを生成する一方で、制御された翻訳後修飾はタンパク質の存在量、細胞内局在、およびPERとCRYのリプレッサー活性を制御します。^[30]

時計遺伝子の翻訳後修飾を担うタンパク質には、カゼインキナーゼファミリーのメンバー（カゼインキナーゼ1デルタ（CSNK1D）とカゼインキナーゼ1イプシロン（CSNK1E））とFボックスロイシンリッチリピートタンパク質3（FBXL3）がある。^[31]哺乳類では、CSNK1EとCSNK1Dは、中核的な概日タンパク質のターンオーバーを制御する重要な因子である。^[30]これらのタンパク質のいずれかに対する実験的操作は、キナーゼ活性の変化や概日周期の短縮など、概日周期に劇的な影響をもたらし、さらに、概日時計の中核メカニズムにおける翻訳後調節の重要性を実証している。^[30]これらの変異は、前進睡眠相障害に関与していることから、ヒトで特に注目されている。^[31] BMAL1の小さなユビキチン関連修飾タンパク質修飾も、翻訳後調節の別のレベルとして提案されている。^[30]

概日振動子は、周期が約 24 時間の振動子です。光刺激に反応して、体は生物学的昼と夜を決定するために連携して機能する経路のシステムとネットワークに対応します。時計を正確に保つための調節ネットワークは、翻訳後調節メカニズムの範囲に及びます。概日振動子は、リン酸化、SUMO 化、ユビキチン化、およびヒストンのアセチル化と脱アセチル化によって調節されます。ヒストン尾部の共有結合修飾は、遺伝子がより容易に発現されるようにクロマチン構造のレベルを制御します。タンパク質構造のメチル化はメチル基を追加し、タンパク質機能または遺伝子発現を調節します。ヒストンのメチル化では、DNA 配列を変更することで遺伝子発現が抑制または活性化されます。ヒストンはアセチル化、メチル化、リン酸化の過程を経るが、主要な構造的および化学的変化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）がヒストンにアセチル基を追加または除去し、DNA発現に大きな変化を引き起こすときに起こる。DNA発現を変化させることで、ヒストンのアセチル化およびメチル化は概日時計の動作を制御している。フスティンと同僚は、成熟したmRNAを核外に効率的に輸出するにはRNAメチル化が必要であることを示して、哺乳類の概日時計の制御に新たな複雑さを加えた。RNAメチル化を阻害すると、時計遺伝子転写産物が核内に保持され、概日周期が長くなる。^[35]

時計の重要な特徴は、外部刺激に同期する能力です。体内のほぼすべての細胞に細胞自律振動子が存在することから、これらの振動子が時間的にどのように調整されているかという疑問が生じます。哺乳類の末梢時計の普遍的なタイミングの手がかりの探求により、摂食、温度、酸素などの主要な同調信号が得られました。摂食リズムと温度サイクルの両方が末梢時計を同期させ、脳のマスター時計から切り離すことさえあることが示されました（例：昼間の摂食制限）。酸素リズムも培養細胞の時計を同期させることがわかっています。^[36]

システム生物学を用いた現代の実験的アプローチでは、生物時計の多くの新しい要素が特定されており、生物が概日リズムを維持する方法についての統合的な見方を示唆している。^{[27] [28]}

最近、Baggs らは、遺伝子の変動に対する生物の堅牢性に寄与するヒトの概日時計のネットワーク特性を記述するための「遺伝子用量ネットワーク分析」(GDNA) と呼ばれる新しい戦略を開発しました。[ ^28]研究では、著者らは、哺乳類の概日時計の既知の生化学的制約と一致する遺伝子関連ネットワークを構築するために、不死化ヒト骨肉腫 U2OS 細胞内の時計成分の遺伝子発現に用量依存的な変化を誘発するために、低分子干渉 RNA (siRNA) を使用しました。siRNA の複数用量を使用することで、定量的 PCRが強化され、遺伝子発現の比例応答、相互作用モジュールによる信号伝播、遺伝子発現変化による補償など、概日時計のいくつかのネットワーク特性が明らかになりました。

siRNA 誘導による撹乱後の下流遺伝子発現の比例反応は、ノックダウンされた遺伝子に関して活発に変化した発現レベルを明らかにしました。たとえば、Bmal1 が用量依存的にノックダウンされた場合、Rev-ErbA アルファおよびRev-ErbA ベータmRNA レベルは直線的に比例して減少することが示されました。これは、Bmal1 が Rev-erb 遺伝子を直接活性化するという以前の研究結果を裏付け、さらに Bmal1 が Rev-erb 発現の強力な寄与因子であることを示唆しています。

さらに、GDNA法は、モジュールが遺伝子発現の変化を伝える概日リズムネットワークにおける生物学的リレー機構を研究するための枠組みを提供した。^[28]著者らは、活性化因子と抑制因子の相互作用によるシグナル伝播を観察し、いくつかの時計遺伝子抑制因子間の一方向パラログ補償を明らかにした。例えば、PER1が枯渇するとRev-erbが増加し、Rev-erb抑制因子の標的であるBMAL1の発現を低下させるシグナルが伝播する。

GDNAは、いくつかの転写抑制因子のノックダウンを調べることで、遺伝子パラログが能動的なメカニズムによってアップレギュレーションされるパラログ補償も明らかにしました。このメカニズムにより、遺伝子機能はノックダウン後に非冗長的な方法で置き換えられます。つまり、機能を維持するには1つのコンポーネントで十分です。これらの結果はさらに、時計ネットワークが堅牢性を付与して機能を維持するために、単純な冗長性ではなく能動的な補償メカニズムを利用していることを示唆しています。本質的には、著者らは、観察されたネットワーク機能が遺伝子および環境の摂動に直面しても時計機能を維持するための遺伝子緩衝システムとして協調して機能することを提案しました。^{[28]この論理に従えば、概日振動子のネットワーク機能を調査するために}ゲノミクスを使用できるかもしれません。

Zhangらによる別の研究でも、U2OS細胞株でゲノムワイドな低分子干渉RNAスクリーニングを採用し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を使用して追加の時計遺伝子と修飾因子を同定しました。 ^{[27]約1000個の遺伝子のノックダウンにより、リズムの振幅が減少しました。著者らは、二次スクリーニングで}周期の長さや振幅の増加に対する数百の強力な効果を発見し、確認しました。これらの遺伝子のサブセットの特性評価により、発振器機能に対する用量依存的な効果が実証されました。タンパク質相互作用ネットワーク解析により、数十の遺伝子産物が直接的または間接的に既知の時計成分と関連していることが示されました。パスウェイ解析により、これらの遺伝子は、インスリンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路、細胞周期、および葉酸代謝の成分で過剰に表現されていることが明らかになりました。これらの経路の多くが時計によって制御されていることを示すデータと組み合わせて、Zhangらは、時計が細胞機能の多くの側面と相互に関連していると仮定しました。

システム生物学のアプローチは、概日リズムを、もともと概日振動の調節因子とは考えられていなかった細胞現象に関連付ける可能性があります。たとえば、NHLBIでの2014年のワークショップ^[37]では、より新しい概日ゲノムの発見を評価し、体内時計と多くの異なる細胞プロセスとのインターフェースについて議論しました。

多くの生物に正確な24時間の概日時計が見られますが、それは普遍的ではありません。高緯度北極や高緯度南極に生息する生物は、すべての季節に太陽時を経験するわけではありませんが、冬眠中のクマなど、ほとんどの生物は24時間に近い概日リズムを維持していると考えられています。^[38]地球上のバイオマスの多くは暗黒生物圏に存在し、これらの生物はリズミカルな生理機能を示す可能性がありますが、これらの生物にとって支配的なリズムは概日リズムではない可能性があります。^[39]東西に移動する生物、特に地球を周回する生物の場合、絶対的な24時間位相は、数か月、季節、または年ごとにずれることがあります。

クモの中には、異常に長い、または短い体内時計を示すものもいる。例えば、一部のクモは18.5時間の体内時計を持っているが、それでも24時間周期に同調することができる。この適応により、クモは日の出前に最も活発になり、捕食者を避けることができるのかもしれない。 ^[40] クロゴケグモの体内時計は不規則だが、これは暗い環境を好むためかもしれない。^[41]

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