クローニングベクター

すべてのクローニングベクターには、遺伝子を容易に挿入したり、ベクターから除去したりできる機能が備わっています。これは、多数の固有の制限酵素部位を含むマルチクローニングサイト（MCS）またはポリリンカーです。MCS内の制限酵素部位は、まず制限酵素で切断され、次に同じ酵素で消化されたPCR増幅された標的遺伝子が、 DNAリガーゼを用いてベクターに連結されます。標的DNA配列は、必要に応じて特定の方向にベクターに挿入できます。制限酵素部位は、必要に応じて、別のベクターへのサブクローニングにも使用できます。

他のクローニングベクターでは、リガーゼの代わりにトポイソメラーゼを使用するものもあり、ベクターや挿入断片の制限酵素消化を必要とせずに、より迅速にクローニングを行うことができます。このTOPOクローニング法では、線状ベクターの両端にトポイソメラーゼIを付加することでベクターを活性化し、この「TOPO活性化」ベクターは、PCR産物の5'末端を連結することでPCR産物を受け入れ、その過程でトポイソメラーゼを放出し、環状ベクターを形成します。^{[ 2 ]} DNA消化とリガーゼを使用しない別のクローニング法は、例えばGatewayクローニングシステムやGibsonアセンブリで使用されるDNA組換え法です。^{[ 3 ] [ 4 ]}クローニングベクターにクローニングされた遺伝子（この方法ではエントリークローンと呼ばれる）は、組換えによってさまざまな発現ベクターに容易に導入できます。^{[ 5 ]}

ベクターには選択マーカーが搭載されており、形質転換された細胞 を選択できるようになっている。抗生物質耐性はマーカーとしてよく用いられ、例えば、アンピシリンなどのペニシリン系β-ラクタム系抗生物質や、テトラサイクリン、カナマイシンA、クロラムフェニコールなどの他のクラスの抗生物質に対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子などが挙げられる。^{[ 6 ]}一部のベクターには2つの選択マーカーが含まれており、例えばプラスミドpACYC177にはアンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の両方が含まれている。^{[ 7 ]} 2つの異なる生物で維持されるように設計されたシャトルベクターにも2つの選択マーカーが必要となる場合があるが、ゼオシン耐性やハイグロマイシンB耐性などの選択マーカーは異なる細胞種で有効である。 栄養要求性生物が最小培地で増殖できるようにする栄養要求性選択マーカーも使用できる。これらの例としては、対応する栄養要求性酵母株で使用されるLEU2とURA3が挙げられる。 ^{[ 8 ]}

別の種類の選択マーカーでは、クローン化された遺伝子を持つプラスミドのポジティブセレクションが可能になります。これには、バーナーゼ^{[ 9 ]} 、Ccda ^{[ 10 ]}、parD /parE毒素^{[ 11 ] [ 12 ]}など、宿主細胞に致死的な遺伝子の使用が含まれる場合があります。 これは通常、クローニングプロセス中に致死遺伝子を破壊または除去することによって機能し、致死遺伝子がそのまま残っている不成功なクローンは宿主細胞を死に至らしめるため、成功したクローンのみが選択されます。

レポーター遺伝子は、クローニングベクターにおいて、成功したクローンを容易に識別できる特徴を利用して、成功したクローンのスクリーニングを容易にするために用いられます。クローニングベクターに存在するそのような特徴としては、青白選択におけるα相補性のためのlacZαフラグメント、および/または融合タンパク質の産生を容易にするためにMCSとインフレームで隣接して配置されたマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子などが挙げられます。スクリーニングに使用できる融合パートナーの例としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）やルシフェラーゼなどがあります。

クローニングベクターは、プロモーターやリボソーム結合部位（RBS）など、クローン化された標的遺伝子の発現に適した要素を必ずしも含んでいる必要はありませんが、多くのベクターはこれらを含んでおり、発現ベクターとして機能する場合があります。標的DNAは、選択された宿主における標的遺伝子の発現に必要な特定のプロモーターの制御下にある部位に挿入されます。プロモーターが存在する場合、遺伝子の発現は、タンパク質が必要なときにのみ産生されるように、厳密に制御され誘導可能であることが望ましいです。一般的に使用されるプロモーターには、T7プロモーターやlacプロモーターなどがあります。青白選択などのスクリーニング技術を使用する場合は、プロモーターの存在が必要です。

クローン化DNA配列のプロモーターおよびRBSを持たないクローニングベクターは、例えば、その産物が大腸菌細胞に毒性を示す遺伝子をクローニングする場合などに用いられることがある。また、クローン化DNA配列のプロモーターおよびRBSは、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを最初に作成する際にも不要である。なぜなら、クローン化された遺伝子は、発現が必要な場合に、より適切な発現ベクターにサブクローニングされるのが一般的だからである。

一部のベクターは、例えば試験管内でのmRNA産生など、異種タンパク質の発現を伴わずに転写のみを行うように設計されています。これらのベクターは転写ベクターと呼ばれます。転写ベクターにはポリアデニル化や終結に必要な配列が含まれていない場合があるため、タンパク質産生には使用できない可能性があります。

プラスミドは、自律的に複製する環状染色体外DNAです。これらは標準的なクローニングベクターであり、最も一般的に使用されています。ほとんどの一般的なプラスミドは、最大15 kbのサイズのDNA挿入断片をクローニングするために使用できます。最も初期に一般的に使用されたクローニングベクターの1つは、pBR322プラスミドです。その他のクローニングベクターには、 pUCシリーズのプラスミドがあり、多数の異なるクローニングプラスミドベクターが利用可能です。多くのプラスミドはコピー数が多く、たとえば、pUC19は細胞あたり500～700コピーのコピー数を持ち、^{[ 7 ]}高コピー数は、その後の操作のための組換えプラスミドの収量を増やすため有用です。ただし、クローン化された遺伝子のタンパク質が細胞に毒性がある場合など、特定の状況では低コピー数のプラスミドが好ましい場合があります。^{[ 13 ]}

一部のプラスミドはM13バクテリオファージの複製起点を含んでおり、一本鎖DNAを生成するために使用できる。これらはファージミドと呼ばれ、pBluescriptシリーズのクローニングベクターがその例である。

プラスミドベースのクローニングベクターは分子生物学において広く採用されているため、特性が十分に解明された例は、公共の生物資源センターや非営利のリポジトリに参照資料として保存されており、研究における再現性を支援している。こうしたリポジトリには、AddgeneやBCCM/GeneCornerなどの公共コレクションが含まれる。

クローニングに使用されるバクテリオファージは、λファージとM13ファージです。^{[ 14 ]} ファージに詰め込めるDNAの量には上限があり（最大53kb）、そのため、外来DNAをファージDNAに挿入できるようにするには、ファージクローニングベクターから、溶原性遺伝子などの非必須遺伝子を削除する必要がある場合があります。これは、クローニングベクターとしてλファージを使用する場合、溶菌サイクルのみに関係するためです。^{[ 15 ]} λファージベクターには、挿入ベクターと置換ベクターの2種類があります。挿入ベクターには、5～11kbサイズの外来DNAを挿入できる独自の切断部位が含まれています。置換ベクターでは、切断部位は溶菌サイクルに必須ではない遺伝子を含む領域を挟んでおり、この領域はクローニングプロセスで削除され、DNA挿入物によって置き換えられる可能性があり、8～24 kbのより大きなサイズのDNAが挿入される可能性がある。^{[ 7 ]}

ファージに詰め込めるDNAのサイズにも下限があり、小さすぎるベクターDNAはファージに適切に詰め込むことができません。この特性は選択に利用できます。挿入配列のないベクターは小さすぎる可能性があるため、挿入配列のあるベクターのみを選択して増殖させることができます。^{[ 16 ]}

コスミドは、バクテリオファージλ DNAのコヒーシブエンドサイト（ cos ）を持つセグメントを組み込んだプラスミドであり、このコヒーシブエンドサイトには、DNAをλ粒子にパッケージングするために必要な要素が含まれています。適切な複製起点（ori）の下では、プラスミドとして複製することができます。通常、28～45 Kbの大きなDNA断片をクローニングするために使用されます。^{[ 7 ]}

細菌人工染色体（BAC）には、最大350 kbの挿入サイズをクローニングできます。BACは、細胞あたり1コピーのみで大腸菌内で維持されます。 ^{[ 7 ]} BACはFプラスミド に基づいており、 PACと呼ばれる別の人工染色体はP1ファージに基づいています。

酵母人工染色体は、1メガベース（1Mb=1000kb）を超えるサイズのDNA断片をクローニングするためのベクターとして使用されます。これらは、ヒトゲノムプロジェクトなどのゲノムマッピングに必要な、より大きなDNA断片のクローニングに役立ちます。酵母人工染色体には、テロメア配列、自律複製配列（酵母細胞内で線状染色体を複製するために必要な特徴）が含まれています。また、これらのベクターには、外来DNAをクローニングするための適切な制限酵素部位や、選択マーカーとして使用される遺伝子も含まれています。

ヒト人工染色体は、ヒト細胞への遺伝子導入のための遺伝子導入ベクターとして、また発現研究やヒト染色体機能の決定のためのツールとして、潜在的に有用である可能性がある。非常に大きなDNA断片を運ぶことができる（実用的な目的においてはサイズの上限はない）ため、他のベクターのクローニング能力の制限という問題がなく、またウイルスベクターによる宿主染色体への組み込みによって引き起こされる可能性のある挿入突然変異も回避できる。^{[ 17 ] [ 18 ]}

植物細胞や動物細胞に感染するウイルスは、外来遺伝子を植物細胞や動物細胞に導入するためにも操作されてきた。ウイルスは細胞に吸着し、DNAを導入し、複製する自然な能力を持っているため、培養中の真核細胞に外来DNAを導入するのに理想的な媒体となっている。哺乳類細胞を用いた最初のクローニング実験では、シミアンウイルス40（SV40）をベースとしたベクターが使用された。アデノウイルスやパピローマウイルスなど、他の種類のウイルスをベースとしたベクターも、哺乳類の遺伝子クローニングに数多く使用されてきた。現在では、レトロウイルスベクターが哺乳類細胞の遺伝子クローニングに広く用いられている。カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物の場合、限られた成功しか収めていない。