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キャピラリー電気泳動( CE ) は、サブミリメートル径のキャピラリーおよびマイクロ流体チャネルやナノ流体チャネルで行われる電気動的分離法のファミリーです。CE は多くの場合、キャピラリーゾーン電気泳動( CZE ) を指しますが、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等電点電気泳動(CIEF)、キャピラリー等速電気泳動、ミセル電気動的クロマトグラフィー(MEKC) などの他の電気泳動技術もこのクラスの方法に属します。[ 1 ] CE 法では、分析対象物は電場の影響下で電解質溶液中を移動します。分析対象物は、イオン移動度および/または非共有結合相互作用による別の相への分配に応じて分離できます。さらに、分析対象物は、導電率とpHの勾配によって濃縮または「フォーカス」されることがあります。
キャピラリー電気泳動を行うために必要な装置は比較的単純です。キャピラリー電気泳動システムの基本的な概略図を図 1に示します。システムの主要構成要素は、サンプル バイアル、ソース バイアルとデスティネーション バイアル、キャピラリー、電極、高電圧電源、検出器、およびデータ出力および処理装置です。ソース バイアル、デスティネーション バイアル、およびキャピラリーには、水性緩衝溶液などの電解質が満たされています。サンプルを導入するには、キャピラリーの入口をサンプルを含むバイアルに挿入します。サンプルは、毛細管現象、圧力、サイフォン、または電気泳動によってキャピラリーに導入され、その後キャピラリーはソース バイアルに戻されます。分析対象物の移動は、ソース バイアルとデスティネーション バイアルの間に印加され、高電圧電源によって電極に供給される電場によって開始されます。最も一般的な CE モードでは、すべてのイオン (正または負) が電気浸透流によって同じ方向にキャピラリーを通って引き込まれます。分析対象物は、電気泳動移動度によって移動しながら分離し、キャピラリーの出口端付近で検出されます。検出器の出力は、積分器やコンピュータなどのデータ出力および処理装置に送られます。データは、検出器の応答を時間の関数として報告する電気泳動図として表示されます。分離された化学化合物は、電気泳動図で異なる移動時間のピークとして現れます。[ 2 ]この技術は、この技術の能力を最初に実証したJames W. JorgensenとKrynn DeArman Lukacsに帰属されることが多いです。 [ 3 ]キャピラリー電気泳動は、 Richard D. Smithとその同僚によって初めて質量分析法と組み合わされ、非常に小さなサンプルサイズの分析に対して非常に高い感度を提供します。非常に小さなサンプルサイズ（通常、キャピラリーに導入される液体はわずか数ナノリットル）にもかかわらず、分析対象物をキャピラリーの入口付近の狭いゾーンに濃縮する注入戦略により、高い感度とシャープなピークが達成されます。これは、圧力注入または電気泳動注入のいずれにおいても、サンプルを泳動バッファーよりも導電率の低いバッファー（例えば、塩濃度の低いバッファー）に懸濁させることで実現されます。フィールド増幅サンプルスタッキング（等速電気泳動の一種）と呼ばれるプロセスその結果、分析対象物質は、低導電率のサンプルと高導電率のランニングバッファーとの境界にある狭い領域に集中する。
サンプル処理能力を向上させるため、多数のサンプルを同時に分析できる毛細管アレイを備えた装置が用いられています。16本または96本の毛細管を備えたこのような毛細管アレイ電気泳動（CAE）装置は、中～高スループットの毛細管DNAシーケンスに使用され、毛細管の入口端は、SBS規格の96ウェルプレートから直接サンプルを受け入れるように空間的に配置されています。装置の特定の側面（検出など）は、単一毛細管システムよりも必然的に複雑になりますが、設計と動作の基本原理は図1に示すものと類似しています。
キャピラリー電気泳動による分離は、いくつかの検出装置で検出できます。市販のシステムの大部分は、検出の主な方法としてUVまたはUV-Vis吸光度を使用しています。これらのシステムでは、キャピラリー自体の一部が検出セルとして使用されます。オンチューブ検出を使用することで、分離された分析対象物を分解能を損なうことなく検出できます。一般的に、キャピラリー電気泳動で使用されるキャピラリーは、柔軟性を高めるためにポリマー（多くの場合ポリイミドまたはテフロン）でコーティングされています。ただし、UV検出に使用されるキャピラリーの部分は光学的に透明でなければなりません。ポリイミドコーティングされたキャピラリーの場合、コーティングの一部が通常、数ミリメートルの長さの裸の窓を作るために焼却または削り取られます。このキャピラリーの裸の部分は簡単に破損する可能性があるため、セルの窓の安定性を高めるために透明コーティングされたキャピラリーが利用可能です。キャピラリー電気泳動の検出セルの光路長（約50マイクロメートル）は、従来のUVセル（約1cm ）の光路長よりもはるかに短くなっています。ベール・ランバートの法則によれば、検出器の感度はセルの光路長に比例します。感度を向上させるには、光路長を長くすることができますが、これは分解能の低下につながります。検出点で毛細管自体を拡張して、光路長の長い「バブルセル」を作成するか、図 2に示すように検出点にチューブを追加することができます。ただし、これらの方法はいずれも分離の分解能を低下させます。[ 4 ]加熱と加圧によって毛細管の壁に滑らかな動脈瘤を生成すれば、プラグフローを維持できるため、この低下はほとんど目立ちません。ゲイリー・ゴードンによるこの発明、米国特許第 5061361 号は、通常、吸光光路長を 3 倍にします。UV 吸光検出器で使用すると、セル内の分析対象物の断面積が広くなるため、照射ビームが 2 倍になり、ショットノイズが 2 分の 1 に減少します。これら2つの要素が相まって、アジレント・テクノロジー社のバブルセルCE検出器の感度は、直線毛細管を用いた検出器の6倍に向上します。このセルとその製造方法については、ヒューレット・パッカード・ジャーナル1995年6月号の62ページに記載されています。
蛍光検出は、自然に蛍光を発するサンプル、または蛍光タグを含むように化学的に修飾されたサンプルに対して、キャピラリー電気泳動でも使用できます。この検出モードは、これらのサンプルに対して高い感度と改善された選択性を提供しますが、蛍光を発しないサンプルには利用できません。タンパク質やDNAなどの非蛍光分子の蛍光誘導体またはコンジュゲートを作成するために、多数の標識戦略が使用されています。キャピラリー電気泳動システムでの蛍光検出のセットアップは複雑になる可能性があります。この方法では、光ビームをキャピラリーに集束させる必要がありますが、これは多くの光源では困難です。[ 4 ]レーザー誘起蛍光は、10 −18～ 10 −21 molという低い検出限界でCEシステムで使用されています。この技術の感度は、入射光の高い強度と、光をキャピラリーに正確に集束させる能力に起因します。[ 2 ] 多色蛍光検出は、複数のダイクロイックミラーとバンドパスフィルターを使用して蛍光発光を複数の検出器（例えば、光電子増倍管）に分離するか、プリズムまたは回折格子を使用してスペクトル分解された蛍光発光をCCDアレイなどの位置検出検出器に投影することによって実現できます。4色および5色のLIF検出システムを備えたCEシステムは、キャピラリーDNAシーケンスおよびジェノタイピング（「DNAフィンガープリンティング」）アプリケーションで日常的に使用されています。[ 5 ] [ 6 ]
サンプル成分の同定には、キャピラリー電気泳動を質量分析計または表面増強ラマン分光法（SERS）と直接組み合わせることができます。ほとんどのシステムでは、キャピラリー出口はエレクトロスプレーイオン化（ESI）を利用するイオン源に導入されます。生成されたイオンは質量分析計で分析されます。このセットアップには揮発性緩衝溶液が必要であり、これは使用できる分離モードの範囲と達成できる分解能の程度に影響します。[ 4 ] 測定と分析は主に特殊な装置で行われます。
CE-SERSでは、キャピラリー電気泳動溶出液をSERS活性基板上に堆積させることができます。キャピラリー電気泳動中にSERS活性基板を一定速度で移動させることで、分析対象物の保持時間を空間距離に変換できます。これにより、後続の分光法を特定の溶出液に適用して、高感度で識別することが可能になります。SERS活性基板は、分析対象物のスペクトルに干渉しないものを選ぶことができます。[ 7 ]
キャピラリー電気泳動による化合物の分離は、印加された電場における分析対象物の異なる移動に依存する。電気泳動移動速度（分析対象物が反対の電荷を持つ電極に向かう方向は、次の通りです。
電気泳動移動度は、移動時間と電場強度から実験的に決定することができる。
どこは入口から検出点までの距離です。は、分析対象物が検出点に到達するのに必要な時間（移動時間）です。は印加電圧（電界強度）であり、は毛細管の全長です。[ 4 ]電場の影響を受けるのは荷電イオンのみであるため、中性分析物は毛細管電気泳動では分離されにくいです。
キャピラリー電気泳動における分析対象物の移動速度は、緩衝溶液の電気浸透流（EOF）の速度にも依存します。典型的なシステムでは、電気浸透流は負に帯電した陰極に向かって流れ、緩衝液はキャピラリーを通って供給バイアルから目的地バイアルへと流れます。電気泳動移動度の違いにより、分析対象物は反対の電荷を持つ電極に向かって移動します。[ 2 ]その結果、負に帯電した分析対象物はEOFに逆らって正に帯電した陽極に引き寄せられ、正に帯電した分析対象物は図3に示すようにEOFに一致して陰極に引き寄せられます。
電気浸透流の速度、次のように書くことができます。
どこ電気浸透移動度とは、次のように定義されるものです。
どこは毛細管壁のゼータ電位であり、は緩衝溶液の比誘電率です。実験的には、電気浸透移動度は中性分析物の保持時間を測定することによって決定できます。[ 4 ] 速度（分析対象物の電場における）は、次のように定義できる。
緩衝溶液の電気浸透流は一般的に分析対象物の電気泳動移動度よりも大きいため、すべての分析対象物は緩衝溶液とともに陰極に向かって運ばれます。小さな三重に帯電した陰イオンでさえ、緩衝溶液の比較的強い電気浸透流によって陰極に方向転換されることがあります。負に帯電した分析対象物は、電気泳動移動度が相反するため、毛細管内に長く保持されます。[ 2 ]検出器で観察される移動の順序は図3に示されています。小さな多価陽イオンは速く移動し、小さな多価陰イオンは強く保持されます。[ 4 ]
電気浸透流は、内壁に固定電荷を持つ毛細管内の溶液に電場を印加したときに観察されます。緩衝溶液を毛細管内に入れると、毛細管の内面に電荷が蓄積されます。溶融シリカ毛細管では、毛細管の内壁に付着したシラノール（Si-OH）基が、pH値が3より大きい場合に負に帯電したシラノエート（Si- O- ）基にイオン化されます。緩衝溶液を導入する前に、 NaOHやKOHなどの塩基性溶液を毛細管に通すことで、毛細管壁のイオン化を促進できます。負に帯電したシラノエート基に引き寄せられた緩衝溶液の正に帯電した陽イオンは、図4に示すように、毛細管壁上に2つの陽イオンの内層（拡散二重層または電気二重層と呼ばれる）を形成します。最初の層は、シラノエート基にしっかりと付着しているため、固定層と呼ばれます。可動層と呼ばれる外層は、シラノエート基から遠い位置にあります。可動カチオン層は、電場が印加されると負に帯電した陰極の方向に引っ張られます。これらのカチオンは溶媒和されているため、バルク緩衝溶液は可動層とともに移動し、緩衝溶液の電気浸透流を引き起こします。テフロンキャピラリーを含む他のキャピラリーも電気浸透流を示します。これらのキャピラリーのEOFは、緩衝液の帯電イオンがキャピラリー壁に吸着した結果であると考えられます。 [ 2 ] EOFの速度は、電場の強度とキャピラリー壁の電荷密度に依存します。壁の電荷密度は、緩衝溶液のpHに比例します。電気浸透流は、キャピラリー壁に沿って存在するすべてのシラノールが完全にイオン化されるまで、pHとともに増加します。[ 4 ]
陰極への強い電気浸透流が望ましくない特定の状況では、キャピラリーの内表面をポリマー、界面活性剤、または小分子でコーティングして電気浸透を非常に低いレベルに低減し、通常の移動方向（陰イオンは陽極へ、陽イオンは陰極へ）を回復させることができます。CE 装置には通常、極性を反転できる電源が含まれており、同じ装置を「通常」モード（EOF と検出がキャピラリーの陰極端付近で行われる）と「逆」モード（EOF が抑制または反転され、検出がキャピラリーの陽極端付近で行われる）で使用できます。1985 年に Stellan Hjertén によって報告された、EOF を抑制する最も一般的なアプローチの 1 つは、線状ポリアクリルアミドの共有結合層を作成することです。[ 8 ] 毛細管のシリカ表面は、まず重合可能なビニル基を有するシラン試薬（例えば、3-メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン）で修飾され、続いてアクリルアミドモノマーとフリーラジカル開始剤が導入される。アクリルアミドはin situで重合し、長い線状鎖を形成し、その一部は壁に結合したシラン試薬に共有結合する。毛細管表面の共有結合修飾には、他にも多くの戦略が存在する。動的または吸着コーティング（ポリマーまたは小分子を含む）も一般的である。[ 9 ] 例えば、DNAの毛細管シーケンスでは、ふるい分けポリマー（典型的にはポリジメチルアクリルアミド）が電気浸透流を非常に低いレベルに抑制する。[ 10 ] 電気浸透流を調節する以外にも、毛細管壁コーティングは、「粘着性のある」分析物（タンパク質など）と毛細管壁との相互作用を低減する目的にも役立つ。このような壁面と分析対象物質との相互作用が深刻な場合、ピーク効率の低下、非対称な（テーリング）ピーク、あるいは分析対象物質が毛細管壁に完全に失われるといった形で現れる。
キャピラリー電気泳動における理論段数、すなわち分離効率は、次式で与えられる。
どこ理論段数、は分離媒体中の見かけの移動度であり、は分析対象物の拡散係数です。この式によれば、分離効率は拡散のみによって制限され、電場の強度に比例しますが、実際的な考慮事項により、電場の強度は1センチメートルあたり数百ボルトに制限されます。非常に高い電位（>20～30 kV）を印加すると、キャピラリーのアーク放電や破壊につながる可能性があります。さらに、強い電場を印加すると、キャピラリー内の緩衝液が抵抗加熱（ジュール加熱）されます。十分に高い電場強度では、この加熱はキャピラリー内に半径方向の温度勾配が発生するほど強くなります。イオンの電気泳動移動度は一般的に温度に依存するため（温度依存性のイオン化と溶媒粘度効果の両方による）、温度プロファイルが不均一になると、キャピラリー全体で電気泳動移動度が変動し、分解能が低下します。顕著なジュール加熱の開始は、「オームの法則プロット」を作成することによって決定できます。このプロットでは、キャピラリーを流れる電流が印加電位の関数として測定されます。低電場では、電流は印加電位に比例します（オームの法則）。一方、高電場では、加熱によって緩衝液の抵抗が減少するため、電流は直線から外れます。通常、最適な分解能は、ジュール熱が無視できる最大電場強度（つまり、オームの法則のプロットの線形領域と非線形領域の境界付近）で得られます。一般的に、内径の小さい毛細管は、放熱性が向上し、大きな毛細管に比べて温度勾配が小さいため、より高い電場強度での使用に適していますが、経路長が短いため吸光度検出の感度が低下し、緩衝液とサンプルを毛細管に導入するのがより困難になるという欠点があります（小さな毛細管では、液体を毛細管に通すために、より大きな圧力と/またはより長い時間が必要になります）。
キャピラリー電気泳動分離の効率は、通常、HPLCなどの他の分離技術の効率よりもはるかに高い。HPLCとは異なり、キャピラリー電気泳動では相間の物質移動がない。 [ 4 ] さらに、EOF駆動システムの流れプロファイルは、図5に示すように、クロマトグラフィーカラムの圧力駆動流に特徴的な丸みを帯びた層流プロファイルではなく、平坦である。その結果、EOFは圧力駆動クロマトグラフィーのようにバンド幅の拡大に大きく寄与しない。キャピラリー電気泳動分離では、数十万の理論段数を持つことができる。[ 11 ]
決議（キャピラリー電気泳動分離の式は次のように表すことができます。
この式によれば、電気泳動移動度と電気浸透移動度の大きさが同程度で符号が逆の場合に、最大の分解能が得られます。さらに、高分解能には低速が必要であり、それに伴い分析時間も長くなることがわかります。[ 4 ]
拡散とジュール加熱（上記で説明）に加えて、キャピラリー電気泳動の分解能を上記の式の理論限界から低下させる可能性のある要因には、注入プラグと検出ウィンドウの有限幅、分析対象物とキャピラリー壁との相互作用、流体リザーバーの高さのわずかな違いによるサイフォニングなどの装置の非理想性、例えば不完全に切断されたキャピラリー端による電場の不規則性、リザーバーの緩衝容量の枯渇、および電気分散（分析対象物の導電率がバックグラウンド電解質よりも高い場合）などが含まれますが、これらに限定されません。[ 12 ] バンド幅の広がりを引き起こす多数の原因を特定して最小限に抑えることが、拡散制限分解能の理想にできるだけ近づけることを目的としたキャピラリー電気泳動のメソッド開発の成功の鍵となります。
毛細管電気泳動法は、唾液中のNH 4 +、 Na +、K +、Mg 2+、Ca 2+イオンの同時測定に使用できる。[ 13 ]
法医学におけるCEの主な用途の1つは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いたDNA断片の増幅および検出法の開発であり、これにより法医学DNA分析が急速かつ劇的に進歩しました。DNA分離は、ふるい分けバッファーで満たされた50mmの薄いCE溶融シリカキャピラリーを使用して行われます。これらのキャピラリーは放熱性に優れているため、スラブゲル電気泳動よりもはるかに高い電場強度を使用できます。したがって、キャピラリーでの分離は迅速かつ効率的です。さらに、キャピラリーは簡単に再充填および交換できるため、効率的で自動化された注入が可能です。検出は、キャピラリーにエッチングされた窓を通して蛍光によって行われます。スループットを向上させるために、16個以上のサンプルを同時に実行できるアレイシステムを備えたシングルキャピラリー装置とキャピラリーアレイ装置の両方が利用可能です。[ 14 ]
法医学生物学者によるCEの主な用途は、生物学的サンプルからSTRをタイピングして、個人間で異なる高度に多型的な遺伝子マーカーからプロファイルを作成することです。CEのその他の新たな用途としては、特定のmRNA断片を検出して、法医学サンプルの生物学的体液または組織の起源を特定するのに役立つことが挙げられます。[ 15 ]
CE の法医学におけるもう 1 つの応用例はインク分析です。インクジェット プリンターで印刷された文書の偽造がますます頻繁になっているため、インクジェット印刷インクの分析の必要性が高まっています。インクの化学組成は、不正な文書や偽造紙幣の場合に非常に重要な情報を提供します。ミセル電気泳動キャピラリークロマトグラフィー (MECC) が開発され、紙から抽出されたインクの分析に適用されています。化学的に類似した複数の物質を含むインクに対する高い分離能により、同じメーカーのインク間の違いも区別できます。これにより、インクの化学組成に基づいて文書の起源を評価するのに適しています。同じカートリッジが異なるプリンター モデルと互換性がある可能性があるため、MECC 電気泳動プロファイルに基づいてインクを区別することは、プリンター モデルよりもインク カートリッジの起源 (製造元とカートリッジ番号) を決定するためのより信頼性の高い方法であることに注意する価値があります。[ 16 ]
CE の特殊なタイプであるアフィニティー キャピラリー 電気泳動(ACE) は、分子間結合相互作用を利用してタンパク質とリガンドの相互作用を理解します。[ 17 ]製薬会社は、さまざまな理由で ACE を使用していますが、主な理由の 1 つは、薬物とリガンド、または薬物とミセルなどの特定の媒体システムとの結合定数です。その簡便性、迅速な結果、および分析対象物の使用量が少ないため、広く使用されている技術です。[ 18 ] ACE を使用すると、分析対象物の結合、分離、および検出に関する詳細な情報が得られ、生命科学の研究に非常に実用的であることが証明されています。アプタマーベースのアフィニティー キャピラリー 電気泳動は、特定のアフィニティー試薬の分析と修飾に使用されます。修飾されたアプタマーは、理想的には高い結合親和性、特異性、およびヌクレアーゼ耐性を示します。[ 19 ] Ren ら修飾ヌクレオチドをアプタマーに組み込むことで、IL-1αとアプタマー間の疎水性および極性相互作用から新たな対立特性と高親和性相互作用を導入した。[ 20 ] HuangらはACEを用いてアプタマーによるタンパク質間相互作用を研究した。α-トロンビン結合アプタマーを6-カルボキシフルオレセインで標識し、選択的蛍光プローブとして使用し、タンパク質間およびタンパク質-DNA相互作用の結合部位に関する情報を明らかにするために研究した。[ 21 ]
キャピラリー電気泳動（CE）は、高スループットかつ高精度のシーケンス情報を提供する、費用対効果の高い重要なDNAシーケンス手法となっています。ウーリーとマティーズは、CEチップを使用して、97%の精度で540秒で150塩基の速度でDNA断片のシーケンスを行いました。 [ 22 ]彼らは、蛍光データを収集するために4色の標識と検出フォーマットを使用しました。蛍光は、核酸配列の各部分（A、T、C、G）の濃度を確認するために使用され、検出からグラフ化されたこれらの濃度ピークを使用してDNAの配列を決定します。[ 22 ]
