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A DNA construct is an artificially-designed segment of DNA borne on a vector that can be used to incorporate genetic material into a target tissue or cell.[1] A DNA construct contains a DNA insert, called a transgene, delivered via a transformation vector which allows the insert sequence to be replicated and/or expressed in the target cell. This gene can be cloned from a naturally occurring gene,[2] or synthetically constructed.[3] The vector can be delivered using physical, chemical or viral methods.[4] Typically, the vectors used in DNA constructs contain an origin of replication, a multiple cloning site, and a selectable marker.[2] Certain vectors can carry additional regulatory elements based on the expression system involved.[5]
DNA constructs can be as small as a few thousand base pairs (kbp) of DNA carrying a single gene, using vectors such as plasmids or bacteriophages, or as large as hundreds of kbp for large-scale genomic studies using an artificial chromosome.[2] A DNA construct may express wildtype protein, prevent the expression of certain genes by expressing competitors or inhibitors, or express mutant proteins, such as deletion mutations or missense mutations. DNA constructs are widely adapted in molecular biology research for techniques such as DNA sequencing, protein expression, and RNA studies.[5]
The first standardized vector, pBR220, was designed in 1977 by researchers in Herbert Boyer's lab. The plasmid contains various restriction enzyme sites and a stable antibiotic-resistance gene free from transposon activities.[6]
In 1982, Jeffrey Vieira and Joachim Messing described the development of M13mp7-derived pUC vectors that consist of a multiple cloning site and allow for more efficient sequencing and cloning using a set of universal M13 primers. Three years later, the currently popular pUC19 plasmid was engineered by the same scientists.[7]
目的のDNA配列上の遺伝子は、既存の配列からクローン化することも、合成的に開発することもできます。生物に自然に存在する配列をクローン化するには、まず、DNA配列を認識して切断する制限酵素で、目的遺伝子周辺の生物のDNAを切断します。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して遺伝子を増幅します。通常、このプロセスでは、プライマーと呼ばれる短い配列を使用して、最初に目的配列にハイブリダイズさせます。さらに、プライマー配列に点突然変異を導入し、各サイクルでコピーして目的配列を改変することができます。[ 2 ]
DNA構築物用の標的DNA鎖を合成することも可能です。オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いDNA鎖は、カラムベースの合成法を用いて作製できます。この方法では、固相に固定されたDNA鎖に塩基を1つずつ付加していきます。各塩基には、結合を防ぐための保護基があり、次の塩基を付加する準備が整うまでこの保護基は除去されないため、正しい順序で結合されることが保証されます。オリゴヌクレオチドはマイクロアレイ上でも合成でき、これにより数万の配列を一度に合成できるため、コストを削減できます。[ 3 ]より大きな遺伝子を合成するには、オリゴヌクレオチドの両端に重複する配列を作製し、それらを結合します。最も一般的な方法は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（PCA）と呼ばれる方法です。断片は重複領域でハイブリダイズして伸長され、各サイクルでより大きな断片が作成されます。[ 2 ]
配列が単離されたら、それをベクターに挿入する必要があります。これを行う最も簡単な方法は、制限酵素を使用してベクターDNAを切断することです。同じ酵素を使用して標的配列を単離した場合、両端に同じ「オーバーハング」配列が作成され、ハイブリダイゼーションが可能になります。標的遺伝子がベクターDNAにハイブリダイズしたら、DNAリガーゼを使用してそれらを結合できます。[ 2 ]別の戦略では、標的遺伝子とベクター配列の相同部位間の組換えを使用し、制限酵素の必要性を排除します。[ 8 ]
DNA構築物の送達には、物理的、化学的、ウイルス的という3つの一般的なカテゴリーがあります。[ 4 ]物理的方法は、細胞に物理的に侵入してDNAを送達するもので、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、バイオリスティクスなどがあります。[ 9 ]化学的方法は、化学反応を利用してDNAを送達するもので、リン酸カルシウムを使用してコンピテント化した細胞による形質転換や、脂質ナノ粒子による送達などがあります。[ 10 ] [ 11 ]ウイルス的方法は、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスなど、さまざまなウイルスベクターを使用してDNAを送達します。[ 12 ]
ベクターには、標的遺伝子に加えて、複製起点、選択マーカー、およびマルチクローニングサイトの3つの重要な要素があります。複製起点は、DNA複製プロセスを開始し、ベクターが自己複製できるようにするDNA配列です。マルチクローニングサイトには、複数の制限酵素の結合部位が含まれており、異なるDNA配列をベクターに挿入しやすくします。選択マーカーは、宿主細胞で容易に選択できる何らかの特性を付与し、形質転換が成功したかどうかを判断できるようにします。最も一般的な選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子であり、構築物を持たない宿主細胞は抗体に曝露されると死滅し、構築物を持つ宿主細胞のみが残ります。[ 2 ]
DNA構築物は、天然タンパク質と人工変異タンパク質の両方を含むタンパク質を生成するために使用できます。これらのタンパク質は、医薬品や抗体などの治療製品の製造に使用できます。DNA構築物は、プロモーターやインヒビターなどの調節配列を発現させることにより、他の遺伝子の発現レベルを変化させることもできます。さらに、DNA構築物は、ゲノムライブラリーの作成、クローン化DNAのシーケンス、RNAおよびタンパク質発現の研究などの研究に使用できます。[ 5 ]