アグロインフィルトレーション

アグロインフィルトレーションは、植物生物学、特に最近では植物バイオテクノロジーで使用されている方法であり、植物、植物から単離した葉、または植物細胞の培養物で遺伝子の一時的な発現を誘導して、目的のタンパク質を生成する。この方法では、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を直接注入または真空浸透によって植物の葉に導入するか、多孔質支持体上に固定化された植物細胞（植物細胞パック）と結合させ、^[1]その後、細菌がT-DNAの転移を介して目的の遺伝子を植物細胞に移入する。従来の植物形質転換と比較した場合のアグロインフィルトレーションの主な利点は、速度と利便性ですが、組み換えタンパク質の収量も一般的に高く、より安定しています。

最初のステップは、目的の遺伝子をアグロバクテリウム ツメファシエンス株に導入することです。その後、株を液体培地で培養し、得られた細菌を洗浄して適切な緩衝液に懸濁します。次に、この溶液を注射器（針なし）に入れ、注射器の先端を葉の裏側に押し当てながら、同時に葉の反対側に穏やかな逆圧を加えます。次に、アグロバクテリウム懸濁液を気孔から、または場合によっては葉の裏側に作った小さな切り込みから、 葉の内部の空気層に注入します。

真空浸透法は、アグロバクテリウムを植物組織の奥深くまで導入するもう 1 つの方法です。この手順では、葉の円盤、葉、または植物全体を溶液の入ったビーカーに浸し、ビーカーを真空チャンバーに入れます。次に真空を適用して、気孔を介して葉の細胞間空間から空気を押し出します。真空を解除すると、圧力差によって「アグロバクテリウム」懸濁液が気孔を介して葉の葉肉組織に押し出されます。これにより、特定の葉のほぼすべての細胞が細菌と接触する可能性があります。

葉の中に入ると、アグロバクテリウムは細胞間空間に留まり、目的の遺伝子を Ti プラスミド由来の T-DNA の一部として高コピー数で植物細胞に導入する。植物のシグナルが誘導され、植物細胞と細菌との間に物理的な接触が生じると、遺伝子導入が起こる。細菌は穴を掘り、新しい T-DNA 鎖を植物細胞に導入するメカニズムを作り出す。T-DNA は植物の核に移動し、植物の染色体に組み込まれ始める。次に、遺伝子は、すべてのトランスフェクトされた細胞において、適切なプロモーター配列からの RNA 合成によって一時的に発現される（安定した組み込みのための選択は行われない）。植物は、表現型への影響についてモニタリングしたり、実験条件にかけたり、収穫して目的のタンパク質の精製に使用したりすることができる。多くの植物種をこの方法で処理できるが、最も一般的なのはNicotiana benthamianaであり、頻度は低いがNicotiana tabacum である。

培養植物細胞パックにおける一過性発現は、ドイツのフラウンホーファー研究所IVVによって最近特許が取得された新しい手法です。^[2] この技術では、タバコの懸濁培養細胞（例：Nicotiana tabacumのNT1またはBY2細胞株）を濾過により多孔質支持体上に固定化し、十分に通気性のある細胞パックを形成し、次に組換えアグロバクテリウムとともにT-DNAの転移ができるように一定時間培養した後、再濾過して余分な細菌と液体を除去します。細胞パックを湿度の高い環境で数日間まで培養すると、タンパク質の一過性発現が可能になります。分泌されたタンパク質は、緩衝液を加えてさらに濾過することで細胞パックから洗い流すことができます。

目的の構築物を持つアグロバクテリウムを、植物病原性のトマトブッシースタントウイルス（TBSV）のp19タンパク質やトマト黄化えそウイルス（TSWV）のNSsタンパク質^{[3]をコードする遺伝子などのサイレンシング抑制タンパク質遺伝子を持つ別のアグロバクテリウムと一緒に浸透させることは、非常に一般的です。 TBSVは1935年に}トマトで初めて発見され、植物の成長を阻害し、果実を変形させます。 TSWVは1915年にオーストラリアのトマトで発見され、長年、現在ブニヤウイルス科のトスポウイルス属として知られている唯一のメンバーでした。

植物は、細胞内に外来核酸を導入するウイルスやその他の病原体から身を守るために、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）のシステムを開発しました。このシステムでは、二本鎖RNAから小さな干渉RNAが生成され、非在来遺伝子を効率的にサイレンシングする特定の配列分解経路が作成されます。^{[4] [5]}多くの植物ウイルスは、p19やNSなどのタンパク質を進化させることで、さまざまなレベルでPTGS経路を妨害し、植物のPTGSシステムに対抗するメカニズムを開発しました。^{[6] [7] [8]}

p19がどのようにRNAサイレンシングを抑制するのかは正確には明らかではないが、ニコチアナ・ベンサミアナの葉で一時的に発現したタンパク質は、TBSV p19と共浸潤すると最大50倍の収量が得られることが研究で示されている。^{[9] [10]}

TSWVおよび他のトスポウイルスNSタンパク質は、局所的および全身的サイレンシングの両方の抑制因子として効果的であることが示されており、^[11] p19が効果的でないことが示された場合に、p19の有用な代替となる可能性があります。他の研究では、アーティチョーク斑入りクリンクルウイルスのp19は、TBSV p19と同様の、しかしより弱い効果があることが示されています。^[12]

• アグロバクテリウム
• 一時的な表現