人工遺伝子合成

オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドホスホラミダイトと呼ばれる構成要素を用いて化学合成されます。これらは、アミン基、ヒドロキシル基、リン酸基が誤って相互作用するのを防ぐ保護基を持つ、通常のヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドです。ホスホラミダイトを1つずつ添加し、5'ヒドロキシル基を脱保護して新しい塩基を添加する、という手順を繰り返します。鎖は3'から5'の方向に成長しますが、これは生合成とは逆方向です。最後に、すべての保護基が除去されます。しかし、化学プロセスであるため、いくつかの誤った相互作用が発生し、欠陥のある生成物が生じる可能性があります。合成されるオリゴヌクレオチド配列が長くなるほど欠陥が多くなるため、このプロセスは短いヌクレオチド配列の製造にのみ実用的です。現在、生物学的用途に直接使用できる十分な品質のオリゴヌクレオチドの実用的な限界は約200 bp（塩基対）です。HPLCを使用して、適切な配列を持つ生成物を分離することができます。一方、遺伝子チップ上では多数のオリゴヌクレオチドを並行して合成することができる。後続の遺伝子合成手順で最適な性能を発揮させるためには、オリゴヌクレオチドは個別に、かつ大規模に調製する必要がある。

通常、個別に設計されたオリゴヌクレオチドのセットは、自動固相合成装置で作られ、精製され、その後、特異的なアニーリングと標準的なライゲーションまたはポリメラーゼ反応によって連結されます。オリゴヌクレオチドのアニーリングの特異性を向上させるために、合成ステップは、耐熱性DNAリガーゼとポリメラーゼ酵素のセットに依存しています。現在までに、リン酸化された重複オリゴヌクレオチドのライゲーション^{[ 2 ] [ 3 ]} 、 Fok I法^{[ 4 ]} 、遺伝子合成のためのリガーゼ連鎖反応の改良型など、いくつかの遺伝子合成法が報告されています。さらに、いくつかのPCRアセンブリアプローチが報告されています^{[ 9 ]} 。これらは通常、互いに重複する40～50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用します。これらのオリゴヌクレオチドは、両鎖の配列の大部分をカバーするように設計されており、全長分子は、オーバーラップ伸長（OE）PCR ^{[ 9 ]} 、熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト（TBIO）PCR ^{[ 10 ] 、または組み合わせたアプローチ[ 11 ]}によって段階的に生成されます。最も一般的に合成される遺伝子のサイズは600～1,200 bpですが、1,000 bp未満の以前に組み立てられた断片を連結することによって、はるかに長い遺伝子が作られています。このサイズ範囲では、自動シーケンス法によってクローン化された合成遺伝子の配列を確認するために、いくつかの候補クローンをテストする必要があります。

さらに、全長遺伝子産物の組み立ては、長い一本鎖オリゴヌクレオチドの効率的かつ特異的なアライメントに依存するため、合成成功のための重要なパラメータには、逆方向反復配列、極端に高いまたは低いGC含量、または反復構造によって生じる二次構造を含む拡張配列領域が含まれます。通常、特定の遺伝子のこれらのセグメントは、手順をいくつかの連続したステップに分割し、より短いサブシーケンスを最終的に組み立てることによってのみ合成できますが、その結果、生産に必要な時間と労力が大幅に増加します。遺伝子合成実験の結果は、使用するオリゴヌクレオチドの品質に大きく依存します。これらのアニーリングベースの遺伝子合成プロトコルでは、製品の品質は、使用するオリゴヌクレオチドの正確さに直接的かつ指数関数的に依存します。あるいは、低品質のオリゴを使用して遺伝子合成を行った後は、クローン解析中の下流の品質保証により多くの労力を費やす必要があり、これは通常、時間のかかる標準的なクローニングおよびシーケンス手順によって行われます。現在のすべての遺伝子合成法に共通するもう一つの問題は、化学合成オリゴヌクレオチドの使用による配列エラーの頻度の高さです。エラーの頻度はオリゴヌクレオチドが長くなるにつれて増加し、結果として、使用するオリゴヌクレオチドが増えるにつれて正しい産物の割合が劇的に減少します。変異の問題は、遺伝子の組み立てに使用するオリゴヌクレオチドを短くすることで解決できます。しかし、すべてのアニーリングベースのアセンブリ法では、プライマーを1つのチューブ内で混合する必要があります。この場合、オーバーラップが短いと、相補的なプライマーの正確かつ特異的なアニーリングが必ずしも可能ではなく、結果として全長産物の形成が阻害されます。オリゴヌクレオチドの手動設計は手間のかかる手順であり、目的の遺伝子の合成が成功するとは限りません。ほぼすべてのアニーリングベースの方法の最適なパフォーマンスを得るには、すべてのオリゴヌクレオチドのオーバーラップ領域の融解温度が類似している必要があります。必要なプライマーの最適化は、専用のオリゴヌクレオチド設計プログラムを使用して実行する必要があります。これまでに、遺伝子合成のための自動プライマー設計に関するいくつかのソリューションが提案されています。^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

オリゴヌクレオチドの品質に関連する問題を克服するために、別々に調製されたフィッシングオリゴヌクレオチド^{[ 15 ]} 、 mutSファミリーのミスマッチ結合酵素^{[ 16 ]}、または細菌やファージ由来の特異的エンドヌクレアーゼ^{[ 17 ]}を用いるなど、いくつかの精巧な戦略が開発されてきた。しかしながら、これらの戦略はすべて、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングに基づく遺伝子合成の時間とコストを増加させる。

大規模並列シーケンスは、複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングし、正確な分子を回収するためのツールとしても使用されています。あるアプローチでは、オリゴヌクレオチドを454パイロシーケンスプラットフォームでシーケンスし、ロボットシステムが正確な配列に対応する個々のビーズを画像化してピックアップします。^{[ 18 ]}別のアプローチでは、大規模並列シーケンスの前に、複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーを独自のフランキングタグで修飾します。タグ指向プライマーを使用すると、ダイヤルアウトPCRによって目的の配列を持つ分子を回収できます。^{[ 19 ]}

遺伝子は、機能的に関連する遺伝子や、単一の遺伝子上の複数の配列バリアントを含むセットとして順序付けられることが増えています。モノクローナル抗体など、開発中の治療用タンパク質のほぼすべては、機能や発現の改善のために多くの遺伝子バリアントをテストすることによって最適化されています。コドン最適化は、合成遺伝子やDNAワクチンの設計に応用されています。最近のツールには、配列の特徴を使用してコドン最適化をガイドするColiFormerなどの機械学習モデルがあり、公開実装はパブリックHugging Face Spaceとして利用可能です。^{[ 20 ] [ 21 ]}

従来の核酸合成ではアデニン、チミン、グアニン、シトシンの4種類の塩基対しか使用されないが、将来のオリゴヌクレオチド合成では、自然界には存在しない人工的に設計・合成された核酸塩基である非天然塩基対の使用が取り入れられる可能性がある。

2012年、カリフォルニア州サンディエゴにあるスクリップス研究所の化学生物学者フロイド・ロメスバーグ率いるアメリカ人科学者グループは、彼のチームが非天然塩基対（UBP）を設計したと発表した。この2つの新しい人工ヌクレオチド、すなわち非天然塩基対（UBP）は、 d5SICSとdNaMと名付けられた。より技術的に言えば、疎水性核酸塩基を持つこれらの人工ヌクレオチドは、2つの融合芳香環を持ち、DNA中で（d5SICS–dNaM）複合体または塩基対を形成する。2014年、スクリップス研究所の同じチームは、ロメスバーグの研究室が設計した最も優れたUBPとともに天然のTAおよびCG塩基対を含むプラスミドと呼ばれる環状DNAを合成し、それを一般的な細菌である大腸菌の細胞に挿入したところ、非天然塩基対が複数世代にわたって正常に複製されたと報告した。これは、生物が拡張された遺伝暗号を次世代に伝達した最初の既知の例である。これは、 d5SICSTPとdNaMTPの両方の三リン酸を効率的に大腸菌に取り込むヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現する補助的な藻類遺伝子を追加することによって部分的に達成された。その後、細菌の自然な複製経路がそれらを利用して、 d5SICS–dNaMを含むプラスミドを正確に複製する。

3番目の塩基対の組み込みに成功したことは、DNAによってコード化できるアミノ酸の数を既存の20種類から理論的に可能な172種類へと大幅に拡大するという目標に向けた重要な突破口であり、それによって生物が新しいタンパク質を生成する可能性が拡大する。^{[ 22 ]}将来的には、これらの非天然塩基対は合成され、DNAプリンティング法によってオリゴヌクレオチドに組み込まれる可能性がある。

エンドヌクレアーゼは核酸断片を認識して切断する酵素であり、DNAアセンブリの誘導に利用できます。様々な種類の制限酵素の中でも、II型制限酵素は切断部位が認識部位の近傍または認識部位内にあるため、最も一般的に利用されています。したがって、エンドヌクレアーゼを用いたアセンブリ法では、この特性を利用してDNA断片やアセンブリプロトコルを定義します。

バイオブリックス

BioBricksアセンブリ標準は、2003年にTom Knightによって記述および導入され、それ以来継続的に更新されています。^{[ 25 ]}現在、最も一般的に使用されているBioBricks標準は、アセンブリ標準10、またはBBF RFC 10です。BioBricksは、DNAパーツがBioBricksアセンブリ方法と互換性を持つために必要なプレフィックスおよびサフィックス配列を定義し、BioBricks形式のすべてのDNAパーツを結合できるようにします。

プレフィックスには EcoRI、NotI、XBaI の制限酵素部位が含まれ、サフィックスには SpeI、NotI、PstI の制限酵素部位が含まれます。プレフィックスとサフィックス領域以外では、DNA パーツにこれらの制限酵素部位が含まれていてはなりません。2 つの BioBrick パーツを結合するには、一方のプラスミドを EcoRI と SpeI で消化し、もう一方のプラスミドを EcoRI と XbaI で消化します。2 つの EcoRI オーバーハングは相補的であるため、アニーリングします。一方、SpeI と XbaI も相補的なオーバーハングを生成するため、連結できます。結果として得られるプラスミドには元のプレフィックスとサフィックスの配列が含まれているため、さらに多くの BioBricks パーツと結合するために使用できます。^{[ 26 ]}この特性により、BioBricks アセンブリ標準は本質的に冪等であると言われています。ただし、2 つの融合 BioBricks の間には「スカー」配列 (TACTAG または TACTAGAG) も形成されます。これにより、BioBricks が融合タンパク質の作成に使用されることが防止されます。6bp のスカー配列はチロシンと終止コドンをコードし、最初のドメインが発現された後に翻訳が終了し、8bp のスカー配列はフレームシフトを引き起こし、コドンの連続的な読み取りを防止します。たとえば 6bp のスカーを与える代替スカー配列、または終止コドンを含まないスカー配列を提供するために、BB-2 アセンブリ、BglBricks アセンブリ、Silver アセンブリ、Freiburg アセンブリなどの他のアセンブリ標準が設計されました。^{[ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]}

BioBrick部品を組み立てる最も簡単な方法は上記のとおりですが、標準的な組み立て方法よりも多くの利点を提供する、一般的に使用されている他の組み立て方法もいくつか存在します。3抗生物質（3A）組み立てでは、抗生物質の選択によって正しい組み立て方法を選択できますが、増幅インサート組み立ては、3A組み立てで見られる低い形質転換効率を克服することを目的としています。^{[ 31 ] [ 32 ]}

BioBrickアセンブリ標準は、DNAアセンブリに他のタイプのエンドヌクレアーゼを使用する際のインスピレーションにもなっています。たとえば、iBrick標準とHomeRunベクターアセンブリ標準の両方で、II型制限酵素の代わりにホーミングエンドヌクレアーゼが使用されています。^{[ 33 ] [ 34 ]}

II型制限エンドヌクレアーゼアセンブリ

一部のアセンブリ法では、II型制限エンドヌクレアーゼも利用されます。これらのエンドヌクレアーゼは、認識部位から数塩基対離れた位置を切断するという点で、他のII型エンドヌクレアーゼとは異なります。その結果、オーバーハング配列を目的の配列を含むように改変することができます。これにより、II型アセンブリ法には2つの利点があります。すなわち、「傷のない」アセンブリが可能になり、ワンポットで複数のパーツを組み立てることができる点です。II型エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ法には、ゴールデンゲート法とその関連変異体などがあります。

ゴールデンゲート・クローニング

ゴールデンゲートアセンブリプロトコルは、Englerらによって2008年に定義され、元の制限酵素部位がなく、かつスカー配列のない最終構築物が得られるDNAアセンブリ方法を定義するものです。これにより、タンパク質の折り畳みや発現に悪影響を与える可能性のある不要なタンパク質配列を含まずにタンパク質を発現させることができます。4塩基対のオーバーハングを生成するBsaI制限酵素を使用することで、最大240個のユニークな非回文配列をアセンブリに使用できます。^{[ 35 ]}

プラスミドの設計と構築

ゴールデンゲートクローニングでは、組み立てる各DNA断片は、プログラムされたオーバーハング配列を含む内向きのBsaI制限酵素部位で挟まれたプラスミドに配置されます。各DNA断片について、3'オーバーハング配列は、次の下流のDNA断片の5'オーバーハングと相補的です。最初の断片の場合、5'オーバーハングは目的のプラスミドの5'オーバーハングと相補的であり、最後の断片の3'オーバーハングは目的のプラスミドの3'オーバーハングと相補的です。このような設計により、すべてのDNA断片をワンポット反応（すべての反応物を混合する）で組み立てることができ、すべての断片が正しい順序で配置されます。正常に組み立てられた構築物は、元々目的のプラスミドにあったスクリーニングカセットの機能喪失を検出することによって選択されます。^{[ 35 ]}

モクロとゴールデンブレイド

オリジナルのゴールデンゲートアセンブリでは、デスティネーションベクターに単一のコンストラクトしか作成できませんでした。このコンストラクトを後続の反応でエントリーベクターとして使用できるようにするため、MoCloおよびゴールデンブレイド標準が設計されました。^{[ 36 ]}

MoClo規格では、複数の階層にわたるDNAアセンブリを定義する。

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  MoCloアセンブリ規格では、ゴールデンゲートアセンブリで構築された遺伝子を、さらに後続の階層で組み立てることが可能です。この例では、第1階層のゴールデンゲートアセンブリで組み立てられた4つの遺伝子が、第2階層のアセンブリでマルチジーン構造に組み立てられます。

  

  ゴールデンブレイドアセンブリ標準は、ゴールデンゲートアセンブリの第1層を基盤とし、ペアワイズプロトコルによってさらに階層を構築します。4つの第1層デスティネーションベクター（ゴールデンゲートアセンブリで構築）が2つの第2層デスティネーションベクターに組み立てられ、これらが第3層デスティネーションベクターの第3層エントリーベクターとして使用されます。交互に制限酵素（第2層にはBpiI、第3層にはBsaI）が使用されます。

  MoCloおよびGolden Braid組立規格は、オリジナルのGolden Gate組立規格から派生したものである。
  ティア1：ティア1アセンブリは標準的なゴールデンゲートアセンブリであり、遺伝子は構成要素（UTR、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター配列などの遺伝要素をコードするDNAパーツ）から組み立てられます。ティア1デスティネーションベクターの挿入部位の両側には、内側に切断するBpiI制限酵素部位が2つ配置されています。これにより、これらのプラスミドをティア2デスティネーションベクターのエントリーベクターとして使用できます。
• ティア2：ティア2アセンブリでは、ティア1アセンブリで組み立てられた遺伝子をさらに組み合わせて、マルチジーンコンストラクトを作成します。さらに上位のティアアセンブリが必要な場合は、挿入部位を挟むように内側に切断するBsaI制限酵素部位を追加できます。これらのベクターは、上位ティアコンストラクトのエントリーベクターとして使用できます。

各アセンブリ層では、禁止部位の数を最小限に抑えるために、BsaI および BpiI 制限部位の使用を交互に行い、各層の逐次アセンブリは、ゴールデンゲート プラスミド設計に従って行われます。全体として、MoClo 標準では、一連のワンポット ゴールデンゲート反応によって、すべて異なる DNA パーツから組み立てられた複数の転写ユニットを含む構築物を組み立てることができます。ただし、MoClo 標準の欠点の 1 つは、最終的な構築物が 4 未満のコンポーネント パーツを必要とする場合、生物学的機能を持たない「ダミー パーツ」を使用する必要があることです。^{[ 37 ]}一方、ゴールデン ブレイド標準では、ペアワイズ ゴールデンゲート アセンブリ標準が導入されました。

ゴールデンブレイド標準は、MoCloと同じ階層型アセンブリ方式を採用していますが、各階層では2つのDNA断片のみを組み立てる、つまりペアワイズ方式を採用しています。したがって、各階層では、目的の配列で遺伝子のペアが目的の断片にクローニングされ、その後、連続する階層で2つずつ組み立てられます。MoCloと同様に、ゴールデンブレイド標準も各階層でBsaIとBpiIの制限酵素を交互に使用します。

ゴールデンゲートアセンブリ法とその派生法の開発により、研究者は合成生物学のワークフローを高速化するツールキットを設計できるようになりました。たとえば、EcoFlexは、 DNAパーツにMoClo標準を使用する大腸菌用のツールキットとして開発されましたが、同様のツールキットは、微細藻類クラミドモナス・ラインハルティのエンジニアリング用に開発されています。^{[ 38 ] [ 39 ]}

Gateway Cloningのエントリーベクターは、まず必要なattB部位を含む合成DNA断片を用いて作製する必要があります。ドナーベクターとの組換えはBPクローナーゼミックスによって触媒され、attL部位を有する目的のエントリーベクターが生成されます。

目的のコンストラクトは、エントリーベクターとデスティネーションベクターを組み換えることによって得られる。この場合、最終的なコンストラクトは、目的とする2つのDNA断片の集合体となる。エントリーベクター上のattL部位が、デスティネーションベクター上のattR部位と組み換えられる。致死遺伝子ccdBはデスティネーションベクターから失われ、不要なベクターを取り込んだ細菌は死滅するため、目的のベクターを選択的に増殖させることができる。

特異的な直交att部位（すなわち、各直交attLは対応するattRとのみ反応する）の発見により、マルチサイトゲートウェイクローニング技術が開発されました。この技術により、att部位によって組み立て順序が制御された複数のDNA断片を組み立てることが可能になります。

主要なゲートウェイクローニング技術の概要。

部位特異的組換えでは、制限酵素の代わりにファージインテグラーゼを使用するため、DNA断片に制限部位を設ける必要がありません。代わりに、インテグラーゼは固有の付着（att）部位を利用し、標的断片と目的ベクター間のDNA再編成を触媒します。Invitrogen Gatewayクローニングシステムは1990年代後半に開発され、BPクローナーゼとLRクローナーゼという2種類の独自の酵素混合物を使用しています。BPクローナーゼ混合物はattB部位とattP部位間の組換えを触媒し、ハイブリッドattL部位とattR部位を生成します。一方、LRクローナーゼ混合物はattL部位とattR部位間の組換えを触媒し、attB部位とattP部位を生成します。各酵素混合物は特定のatt部位のみを認識するため、組換えは非常に特異的であり、断片を目的の配列に組み立てることができます。^{[ 40 ]}

ベクターデザインとアセンブリ

Gatewayクローニングは独自の技術であるため、すべてのGateway反応は製造元が提供するGatewayキットを使用して実施する必要があります。反応は大きく2つのステップに分けられます。最初のステップでは、目的のDNA断片を含むエントリークローンを組み立て、2番目のステップでは、この目的の断片をデスティネーションクローンに挿入します。

1. エントリークローンは、attP部位で挟まれたGatewayカセットを含む付属の「ドナー」ベクターを使用して作成する必要があります。Gatewayカセットには、正常に組換えられたエントリークローンの生存と選択を可能にする細菌自殺遺伝子（例：ccdB）が含まれています。目的のDNA断片を挟むようにattB部位のペアが追加され、BPクローナーゼミックスが添加されたときにattP部位との組換えが可能になります。エントリークローンが作成され、目的の断片はattL部位で挟まれます。
2. 目的ベクターにもGatewayカセットが付属していますが、代わりにattR部位が2つ隣接しています。この目的プラスミドをエントリークローンおよびLRクローナーゼミックスと混合すると、attR部位とattL部位の間で組換えが起こります。目的の断片が正常に挿入された目的クローンが生成されます。致死遺伝子は元のベクターに挿入され、このプラスミドで形質転換された細菌は死滅します。このようにして、目的のベクターを容易に選択できます。

Gatewayクローニング法の初期バージョンでは、生成される各デスティネーションクローンに対して1つのエントリークローンしか使用できませんでした。しかし、その後の研究により、さらに4つの直交att配列を生成できることが明らかになり、最大4つの異なるDNA断片の組み立てが可能になりました。このプロセスは現在、マルチサイトGatewayテクノロジーとして知られています。^{[ 41 ]}

Gatewayクローニング以外にも、他のインテグラーゼを用いた非商業的な方法も開発されている。例えば、Serine Integrase Recombination Assembly (SIRA) 法は ΦC31 インテグラーゼを使用し、Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly (SSRTA) 法はストレプトマイセスファージ φBT1 インテグラーゼを使用する。^{[ 42 ] [ 43 ]} HomeRun Vector Assembly System (HVAS) などの他の方法は、Gateway クローニングシステムをベースに、ホーミングエンドヌクレアーゼをさらに組み込んで、合成 DNA 構築物の工業的合成をサポートする可能性のあるプロトコルを設計している。^{[ 33 ]}

近年、長鎖オーバーラップに基づくアセンブリ法が数多く開発されてきた。最も一般的に使用されている方法の 1 つは、2009 年に開発されたギブソンアセンブリ法であり、制限酵素やインテグラーゼの使用を必要としないワンポット DNA アセンブリ法である。^{[ 44 ]}他の同様のオーバーラップに基づくアセンブリ法には、Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC)、Sequence and Ligase Independent Cloning (SLIC)、Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE) などがある。^{[ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]}多くのオーバーラップアセンブリ法が存在するにもかかわらず、ギブソンアセンブリ法は依然として最も普及している。^{[ 48 ]}上記の方法に加えて、他の研究者は、ギブソンアセンブリ法や他のアセンブリ法で使用されている概念に基づいて、Modular Overlap-Directed Assembly with Linkers (MODAL) 戦略や Biopart Assembly Standard for Idempotent Cloning (BASIC) 法などの新しいアセンブリ戦略を開発している。^{[ 49 ] [ 50 ]}

ギブソンアセンブリ

ギブソンアセンブリ法は比較的簡単なDNAアセンブリ法であり、5' T5エキソヌクレアーゼ、Phusion DNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼという少数の追加試薬のみを必要とする。組み立てるDNA断片は、組み立てる順序で5'末端と3'末端が重なるように合成される。これらの試薬を組み立てるDNA断片と50  ℃で混合すると、以下の反応が起こる。

1. T5エキソヌクレアーゼは、各DNA断片の5'末端からDNAを分解し、各DNA断片に3'突出部を露出させる。
2. 隣接するDNA断片上の相補的な突出部は、相補的な塩基対形成によってアニーリングする。
3. Phusion DNAポリメラーゼは、断片がアニーリングした箇所にある隙間を埋める。
4. Taq DNAリガーゼは、両方のDNA鎖の切断箇所を修復する。

T5エキソヌクレアーゼは熱に不安定であるため、 最初の噛み戻しステップの後、50℃で不活性化されます。したがって、生成物は安定しており、フラグメントは目的の順序で組み立てられます。このワンポットプロトコルでは最大5種類の異なるフラグメントを正確に組み立てることができ、市販のキットでは2段階反応で最大15種類の異なるフラグメントを正確に組み立てることができます。^{[ 51 ]}ただし、ギブソンアセンブリプロトコルは高速で比較的少ない試薬を使用しますが、各フラグメントは隣接するフラグメントと重複する配列を含むように設計し、PCRで増幅する必要があるため、特注のDNA合成が必要です。このPCRへの依存は、長いフラグメント、GC含量の高いフラグメント、または反復配列を使用する場合に、反応の忠実度にも影響を与える可能性があります。^{[ 50 ]}

ベーシック

BASICアセンブリ戦略は2015年に開発され、従来のアセンブリ技術の限界に対処することを目的としており、標準の再利用可能な部品、シングルティア形式（すべての部品が同じ形式で、同じプロセスを使用して組み立てられる）、冪等クローニング、並列（マルチパート）DNAアセンブリ、サイズ非依存性、自動化可能性という6つの重要な概念を取り入れています。^{[ 50 ]}

DNAパーツとリンカーの設計

DNA パーツは設計され、ストレージ プラスミドにクローニングされ、パーツは統合されたプレフィックス ( i P) と統合されたサフィックス ( i S) 配列で挟まれています。i Pおよびi S 配列には、BASIC リンカーに相補的なオーバーハングを含む、内向きの BsaI 制限酵素部位が含まれています。^{[ 50 ]} MODAL と同様に、BASIC で使用される 7 つの標準リンカーは R2oDNA Designer ソフトウェアで設計され、シャーシ ゲノムと相同性のある配列が含まれていないこと、および二次構造配列、制限酵素部位、リボソーム結合部位などの不要な配列が含まれていないことを確認するためにスクリーニングされました。各リンカー配列は 2 つの半分に分割され、それぞれに BsaI 制限酵素部位に相補的な 4 bp のオーバーハング、12 bp の二本鎖配列があり、もう一方の半分と 21 bp の重複配列を共有しています。上流側のDNA部分に結合する半分はサフィックスリンカー部分（例：L1S）と呼ばれ、下流側のDNA部分に結合する半分はプレフィックスリンカー部分（例：L1P）と呼ばれます。これらのリンカーは、DNA断片を組み立てるための基礎となります。

標準的なBASICリンカーは、組み立て順序を指示するだけでなく、他の機能も担うように改変することができる。等冪な組み立てを可能にするため、リンカーにはBsaIによる認識を防ぐためのメチル化されたiPおよびiS配列が追加で挿入された。このメチル化は形質転換および生体内でのプラスミド複製後に消失し、プラスミドは抽出、精製され、さらなる反応に使用できる。

リンカー配列は比較的長いため（標準リンカーでは45bp）、機能的なDNA配列を組み込むことで、アセンブリに必要なDNAパーツの数を減らすことができます。BASICアセンブリ標準では、強度の異なるRBSが組み込まれた複数のリンカーが提供されています。同様に、複数のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の構築を容易にするために、DNA構築物を完全に読み通せるように設計された融合リンカーもいくつかあります。これらの融合リンカーは、15個のアミノ酸からなるグリシンとセリンのポリペプチドをコードしており、これは複数のドメインを持つ融合タンパク質にとって理想的なリンカーペプチドです。

BASICアセンブリに使用するDNAパーツには、プレフィックス配列（iP）とサフィックス配列（iS）が組み込まれている必要があります。これらの配列にはBsaI制限酵素認識部位が含まれており、相補的なオーバーハング配列を含むiPリンカーとiSリンカーをDNAパーツに結合させることができます。リンカーが結合されると、パーツはアセンブリの準備が整います。

組み立ての順序は、リンカーの位置によって決まります。サフィックスリンカーは上流断片の3'末端に連結され、プレフィックスリンカーは下流断片の5'末端に連結されます。ここに、4つのDNAパーツを用いたBASICアセンブリ構築物の例を示します。

組み立て

最終構造物の組み立てには、主に3つのステップがあります。

1. まず、DNA断片を貯蔵プラスミドから切り出し、3'末端と5'末端にBsaIオーバーハングを持つDNA断片を得る。
2. 次に、各リンカーパーツはT4 DNAリガーゼを用いてインキュベートすることにより、それぞれのDNAパーツに結合されます。各DNAパーツには、組み立て順序を指示する2種類のリンカー由来の接尾辞と接頭辞のリンカーパーツが付加されます。例えば、配列の最初のパーツにはL1PとL2Sが、2番目のパーツにはL2PとL3Sが付加されます。リンカーパーツを変更することで、組み立て順序を変更できます。
3.  最後に、リンカーが付加された部分を50 ℃でインキュベートすることにより、プラスミドに組み立てる。PリンカーとSリンカーの21 bpの突出部がアニーリングし、最終構築物を細菌細胞に形質転換してクローニングを行う。一本鎖の切断箇所は形質転換後に生体内で修復され、安定な最終構築物がプラスミドにクローニングされる。

合成酵母2.0プロジェクトの一環として、世界中のさまざまな研究グループが合成酵母ゲノムを合成するプロジェクトに参加し、このプロセスを通じてモデル生物であるサッカロミセス・セレビシエのゲノムを最適化しました。^{[ 58 ]}酵母2.0プロジェクトでは、上記で説明したさまざまなDNAアセンブリ法が適用され、2014年3月、ニューヨーク大学ランゴン医療センターのジェフ・ボーケは、彼のチームがS.セレビシエの染色体IIIを合成したことを明らかにしました。^{[ 59 ] [ 60 ]}この手順では、元の染色体の遺伝子を合成バージョンに置き換え、完成した合成染色体を酵母細胞に組み込みました。これには、元の染色体の316,667対よりも少ない273,871塩基対のDNAを設計および作成する必要がありました。 2017年3月時点で、16本の染色体のうち6本の合成が完了しており、残りの合成はまだ進行中であった。^{[ 61 ]}

人工遺伝子合成によるヒトDNAの作成が技術的に可能になった場合、研究者によっていくつかの倫理的および社会的問題が指摘されている^{[ 62 ]} 。アドリアン・ビラルバやアンナ・スマイドールなどの学者は、合成DNAがヒト遺伝物質の性質と重要性に関する既存の前提に疑問を投げかける可能性があると指摘している。懸念される領域の一つは、遺伝子所有権の概念である。個人のDNA配列が実験室で人工的に再現できる場合、結果として生じる物質に対する権利や管理権を誰が持つのか、また現在の法的および倫理的枠組みがそのようなケースに対処するのに十分であるかどうかが不明確になる。

アイデンティティに関する疑問も存在する。ヒトゲノムは従来、個人のアイデンティティや生物学的遺産と密接に結びついていると考えられてきた。しかし、合成DNAによってゲノム配列を再構築または再設計できる可能性は、この関連性を著しく弱めるだろう。ゲノムが自然な遺伝とは無関係に作成、改変、複製できるのであれば、遺伝的構成が個人の特性を厳密に決定するという見方は、ますます維持しにくくなる。このような状況において、合成DNAは遺伝的決定論を効果的に覆し、個人のアイデンティティ形成における遺伝子の役割に関する前提を再評価するきっかけとなるものとして提案されている。

プライバシーもまた重要な問題である。既存の個人の配列と同一または類似の配列を合成できる可能性は、遺伝子データの保護と悪用の可能性について懸念を引き起こす。従来の遺伝情報保護策では、生物学的サンプルとは無関係にDNAを再現できるようなシナリオに十分に対応できない可能性がある。

この技術は、生殖や親子関係に関する議論にも影響を与える可能性がある。合成ゲノム、合成配偶子、あるいは部分的に合成された配列が生殖の場面で使用される場合、遺伝的な親子関係の特定や、生物学的血統に基づく規制の適用がより困難になる可能性がある。これは、生殖補助医療、ドナーの匿名性、そして家族関係の法的定義に影響を与える可能性がある。

ヒト合成DNAに関するさらなる理論的研究では、合成DNAを用いてミトコンドリア小器官を再構築することで、ミトコンドリア置換技術の代替案が提案されている^{[ 63 ]}。このアプローチでは、ミトコンドリアDNAをde novoで作成することで、生殖介入において別途ミトコンドリア提供者を用意する必要がなくなる。著者らは、この開発によって、いわゆる「3人の親を持つ赤ちゃん」という概念が損なわれると主張している。なぜなら、ミトコンドリア配列はもはや3人目の個人から来なくなるからである。さらに、合成手段によってミトコンドリアゲノムを設計および置換できる可能性は、かつては固定されていると考えられていた生物学的遺伝の要素が自然な系統とは独立して生成できるため、遺伝的決定論をさらに弱める。

ヒトの合成DNAをゼロから構築できる可能性は、自然遺伝や生殖補助医療でランダムに選択された配偶子に頼るのではなく、個人が自身の遺伝物質の特定の配列を持つ配偶子を作成できるようにする可能性がある。^{[ 64 ]} 。既存の胚のゲノムを直接変更し、したがって人に影響を与える胚遺伝子編集などの従来の技術とは異なり、これらの合成配偶子はde novoで構築され、そうでなければ存在しなかったであろう個人を生み出すため、この介入はParfitの意味での人に影響を与えない。このようにして生成された配偶子は、体外由来の配偶子形成によって得られた人工配偶子とは異なり、既存の人に影響を与えることなく、生殖の自律性、アイデンティティ、および人間の特性の設計に関する倫理的な問題を提起する。