逆遺伝学

逆遺伝学は分子遺伝学の一手法で、遺伝子内の特定の核酸配列を遺伝子工学的に操作することで生じる表現型効果を分析することで、遺伝子の機能を理解するのに役立ちます。このプロセスは、古典的遺伝学の順方向遺伝学スクリーニングとは逆の方向に進みます。順方向遺伝学が表現型または形質の遺伝的基礎を見つけようとするのに対し、逆遺伝学は特定の遺伝子配列によって制御される表現型を見つけようとします。

自動化されたDNAシーケンシングは、比較的迅速に大量のゲノム配列データを生成します。多くの遺伝子配列は、他の入手が容易でない生物学的情報よりも先に発見されます。逆遺伝学は、特定の遺伝子配列と生物に対する特定の影響を結び付けようとします。^[1]逆遺伝学システムでは、望ましい突然変異を持つ感染性ウイルスや欠陥ウイルスの回復と生成も可能です。^[2]これにより、ウイルスをin vitroおよびin vivoで研究できるようになります。

配列が表現型に与える影響を知ったり、その生物学的機能を発見したりするために、研究者はDNA を変更したり破壊したりすることができます。この変更を行った後、研究者は生物全体におけるそのような変更の影響を調べることができます。逆遺伝学にはいくつかの異なる方法があります。

部位特異的変異誘発は、遺伝子のプロモーター内の調節領域を変更したり、オープンリーディングフレーム内の微妙なコドンの変更を行って、タンパク質機能にとって重要なアミノ残基を特定したりできる高度な技術です。^{[引用が必要]}

あるいは、この技術は、遺伝子が機能しないようにヌル対立遺伝子を作成するために使用できます。たとえば、遺伝子ターゲティング(遺伝子ノックアウト) による遺伝子の削除は、酵母、マウス、コケなどの一部の生物で行うことができます。植物の中ではユニークですが、ヒメツリガネゴケでは、相同組み換えによる遺伝子ノックアウトでノックアウトコケ(図を参照)を作成する方法が、酵母とほぼ同じくらい効率的です。^[4]酵母モデルシステムの場合、酵母ゲノム内のすべての非必須遺伝子で誘導削除が作成されています。^[5]植物モデルシステムの場合、遺伝子破壊コンストラクトに基づいて巨大な変異体ライブラリが作成されています。^[6]遺伝子ノックインでは、内因性エクソンが目的の改変された配列に置き換えられます。^[7]

場合によっては、条件付き対立遺伝子が活性化されるまで遺伝子が正常に機能するように、条件付き対立遺伝子を使用することができます。これには、特定のリコンビナーゼ (CRE、FLP など) が誘導されたときに目的の遺伝子の削除を引き起こすリコンビナーゼサイト (lox サイトや frt サイトなど) の「ノックイン」が必要になる場合があります。Cre または Flp リコンビナーゼは、化学処理、熱ショック処理によって誘導するか、特定の組織サブセットに限定することができます。^{[引用が必要]}

使用できるもう 1 つの技術はTILLINGです。これは、エチルメタンスルホン酸 (EMS)などの化学変異原による標準的で効率的な変異誘発技術と、標的遺伝子の点変異を識別する感度の高い DNA スクリーニング技術を組み合わせた方法です。 ^{[引用が必要]}

ウイルス学の分野では、逆遺伝学の技術を使用して、ウイルスゲノムまたは特定のウイルス遺伝子に所望の変異または挿入を加えた完全長の感染性ウイルスを回復することができます。これらの操作を可能にする技術には、ウエストナイルウイルスの近縁種であるクンジンウイルスの感染性cDNAを生成するために最初に使用された環状ポリメラーゼ伸長反応（CPER）が含まれます。^{[8] CPERは、COVID-19の原因物質であるSARS-CoV-2 [9]}などのさまざまなプラスセンスRNAウイルスを生成するためにも効果的に利用されています。

RNA 干渉(RNAi)としても知られる二本鎖 RNA を使用した遺伝子サイレンシングの発見と、モルフォリノオリゴを使用した遺伝子ノックダウンの開発により、遺伝子発現の阻害がより多くの研究者にとって利用しやすい技術となりました。この方法は、遺伝子ノックアウトが永続的であるのに対し、これらの試薬の効果は一般に一時的であるため、遺伝子ノックダウンと呼ばれることがよくあります。^{[引用が必要]}

RNAi は、対象の DNA を実際に変異させることなく、特定のノックアウト効果を生み出します。C . elegansでは、RNAi はゲノム内のほとんどの遺伝子の発現を体系的に妨害するために使用されています。RNAi は、細胞系に指示を与えて、標的のメッセンジャー RNA (mRNA) を分​​解することによって作用します。^{[引用が必要]}

RNAi干渉、特に遺伝子サイレンシングは、遺伝子の発現を抑制し、機能喪失表現型を特定して分析するための有用なツールとなっている。対立遺伝子に突然変異が発生すると、それが表しコード化する機能も突然変異して失われる。これは一般に機能喪失突然変異と呼ばれる。^[10]機能喪失表現型を分析する能力は、突然変異対立遺伝子にアクセスできない場合でも遺伝子機能を分析することを可能にする。^[11]

RNA 干渉は細胞成分（ダイサータンパク質、RISC 複合体など）に依存して効果を発揮しますが、遺伝子ノックダウンのシンプルな代替手段はモルフォリノアンチセンスオリゴです。モルフォリノは、細胞タンパク質の活性を必要とせず、mRNA の分解を必ずしも加速することなく、標的 mRNA に結合してアクセスをブロックします。モルフォリノは、試験管内の無細胞翻訳から大型動物モデルでの生体内研究まで、さまざまな複雑さのシステムで効果を発揮します。^{[引用が必要]}

分子遺伝学的アプローチは、対象となる正常な遺伝子を過剰発現するトランスジェニック生物を作成することです。結果として得られる表現型は、遺伝子の正常な機能を反映する可能性があります。

あるいは、正常 (野生型) 遺伝子の機能を妨げる突然変異遺伝子を過剰発現させることもできます。たとえば、突然変異遺伝子の過剰発現により、機能しないタンパク質のレベルが高くなり、野生型タンパク質との優性負の相互作用が生じる可能性があります。この場合、突然変異バージョンは野生型タンパク質のパートナーと競合し、突然変異表現型が生じます。

その他の変異体では、異常に調節され恒常的に活性な（常にオンの）タンパク質が生じることがあります。これは、調節ドメインの除去や、可逆的に修飾される（リン酸化、メチル化、またはユビキチン化によって）特定のアミノ残基の変異が原因である可能性があります。どちらの変化もタンパク質機能の調節に重要であり、有益な表現型をもたらすことがよくあります。

逆遺伝学はワクチン合成において大きな役割を果たしています。ワクチンは、感染性ウイルス株の新たな遺伝子型を設計することで作成できます。この遺伝子型は、病原性の効力を弱め、宿主の免疫を促進するのに十分なものです。ワクチン合成に対する逆遺伝学のアプローチでは、既知のウイルス遺伝子配列を利用して、望ましい表現型、つまり病原性の効力が弱められ、現在流行しているウイルス株との類似性を持つウイルスを作成します。逆遺伝学は、熱やその他の化学的方法を使用して殺したウイルスである不活化ワクチンを作成する従来の方法に代わる便利な方法です。

逆遺伝学の方法で作られたワクチンは弱毒化ワクチンとして知られており、弱毒化された生ウイルスを含んでいることからその名が付けられています。弱毒化ワクチンは、新しいまたは現在のウイルス株の遺伝子を、以前に弱毒化された同じ種のウイルスと組み合わせることによって作られます。^[12]弱毒化ウイルスは、鶏卵などの新しい条件下で生ウイルスを増殖させることによって作られます。これにより、まだ生きているがヒトに対して病原性のないウイルス株が生成されます。^[13]これらのウイルスは、増殖して宿主に十分に感染するのに十分なゲノムを複製できないという欠陥があるためです。しかし、ウイルス遺伝子は単一の複製サイクルを通じて宿主の細胞内で依然として発現しており、免疫の発達を可能にします。^[14]

逆遺伝学技術を使用してワクチンを作成する一般的な方法は、プラスミドを使用して弱毒化ウイルスを合成することです。この技術は、インフルエンザワクチンの年間生産で最も一般的に使用されており、8つのプラスミドシステムで効果的なワクチンを迅速に生産できます。インフルエンザAウイルスのゲノム全体は8つのRNAセグメントで構成されているため、6つの弱毒化ウイルスcDNAプラスミドと2つの野生型プラスミドを組み合わせることで、弱毒化ワクチン株を構築できます。インフルエンザワクチンの開発では、それぞれヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質をコードする4番目と6番目のRNAセグメントを循環ウイルスから取得し、他の6つのセグメントは以前に弱毒化されたマスター株から取得します。HAタンパク質とNAタンパク質は抗原の多様性が高いため、ワクチンが製造されている現在の株から取得して、よく一致するワクチンを作成します。^[12]

この8プラスミドシステムで使用されるプラスミドには、ワクチン開発を可能にする3つの主要コンポーネントが含まれています。第一に、プラスミドにはインフルエンザ遺伝子をプラスミドに組み込むことができる制限部位が含まれています。第二に、プラスミドには抗生物質耐性遺伝子が含まれており、正しい遺伝子を含むプラスミドのみを選択できます。最後に、プラスミドには、遺伝子を反対方向に転写するヒトpol 1プロモーターとpol 2プロモーターの2つのプロモーターが含まれています。^[15]

ウイルスRNAのcDNA配列は、RT-PCRを使用して弱毒化マスター株から合成されます。^[12]このcDNAは、制限酵素消化によってRNAポリメラーゼI（Pol I）プロモーターとターミネーター配列の間に挿入できます。次に、cDNAとpol I配列は、RNAポリメラーゼII（Pol II）プロモーターとポリアデニル化部位に囲まれます。^[16]この配列全体がプラスミドに挿入されます。弱毒化マスター株cDNAから得られた6つのプラスミドは、現在循環している野生型インフルエンザ株の2つのプラスミドとともに、標的細胞（多くの場合、鶏卵）に同時トランスフェクトされます。標的細胞内では、2つの「スタックされた」Pol IおよびPol II酵素がウイルスcDNAを転写して、マイナスセンスウイルスRNAとプラスセンスmRNAの両方を合成し、効果的に弱毒化ウイルスを作成します。^[12]その結果、現在のウイルス株に類似した欠陥のあるワクチン株が得られ、宿主が免疫を構築できるようになります。この合成されたワクチン株は、さらなるワクチンを作成するためのシードウイルスとして使用することができます。

逆遺伝学から作られたワクチンは、従来のワクチン設計に比べていくつかの利点がある。最も注目すべきは生産のスピードである。HAおよびNA糖タンパク質の抗原変異が大きいため、逆遺伝学アプローチでは、必要な遺伝子型（現在循環しているウイルス株から採取したHAおよびNAタンパク質を含むもの）を迅速に配合することができる。^[12]さらに、逆遺伝学による弱毒化ワクチン生産の最終製品は生きたウイルスであるため、従来の不活化ワクチンよりも高い免疫原性を示す。^[17]従来の不活化ワクチンは、ワクチンとして移す前に化学的手順で殺さなければならない。しかし、弱毒化ウイルスは生きた性質のため、免疫不全患者では合併症が発生する可能性がある。^[18]また、ウイルスの突然変異により、ワクチンが弱毒化されていない生きたウイルスに戻る可能性もある。^[19]

• フォワード遺伝学

• 再集合 vs. 逆遺伝学
• 逆遺伝学: インフルエンザワクチンを少しずつ構築する