種類 免疫蛍光法による主な抗核抗体 パターン。[ 13 ]
蛍光の準備 免疫蛍光染色を行うには、蛍光色素を 抗体に結合（「標識」）させる必要があります。染色手順は、細胞内に保持された発現抗体、または生細胞上の細胞表面抗原の両方に適用できます。免疫蛍光法には、一次（直接）法と二次（間接）法の2つの一般的なクラスがあります。[ 1 ] [ 2 ] [ 12 ]
一次免疫蛍光法 の基本概念：蛍光色素が結合した抗体が、標的分子上のエピトープに特異的に結合する。一次（直接）免疫蛍光法（DIF）では、蛍光色素 が結合した単一の抗体を使用します。抗体は標的分子（抗原）を認識し、エピトープ と呼ばれる特定の領域に結合します。結合した蛍光色素は蛍光顕微鏡で検出でき、蛍光色素の種類に応じて、励起されると特定の波長の光を発します。[ 1 ] [ 14 ]
蛍光色素を抗体に直接結合させることで、サンプル調製手順のステップ数を減らし、時間を節約し、分析中の非特異的なバックグラウンド信号を低減できます。[ 12 ] [ 2 ] [ 12 ] [ 1 ]
二次免疫蛍光法 の基本概念：蛍光色素が結合した二次抗体が、標的分子上のエピトープに特異的に結合する一次抗体に結合する。
二次（間接）免疫蛍光法（SIF）は直接免疫蛍光法と似ていますが、この手法では2種類の抗体を使用し、そのうち1種類だけが蛍光色素と結合しています。蛍光色素と結合した抗体は二次抗体と呼ばれ、結合していない抗体は一次抗体と呼ばれます。[ 1 ]
この技術の原理は、一次抗体が標的分子上のエピトープに特異的に結合し、一方、蛍光色素が結合した二次抗体が一次抗体を認識して結合するというものである。[ 1 ]
この手法は、複数の二次抗体が同じ一次抗体に結合できるため、一次免疫蛍光法よりも感度が高いと考えられています。抗原あたりの蛍光色素分子の数が増えると、放出される光の量が増え、信号が増幅されます。[ 1 ] [ 15 ] [ 16 ]
制限事項 ABC法 の基本概念：一次抗体は抗原に結合した後、ビオチン化二次抗体に結合します。その後、アビジン-ビオチン酵素複合体（ABC）が二次抗体に結合します。免疫蛍光法は、細胞内の構造を研究する場合、固定された（つまり死んだ）細胞に限定されます。抗体は一般的に大きなタンパク質であるため、生細胞の無傷の細胞膜や細胞内膜を透過しないからです。これらの構造を可視化するには、抗原物質を細胞内の自然な局在にしっかりと固定する必要があります。[ 17 ] 蛍光と組み合わせて生細胞内の構造を研究するには、緑色蛍光タンパク質 （GFP）などの蛍光タンパク質ドメインを含む組換えタンパク質 を利用できます。GFP技術は、細胞の遺伝情報を改変することを含みます。[ 18 ] [ 19 ]
免疫蛍光法の重大な問題の一つは光退色 [ 12 ] [ 1 ] Alexa Fluor 、Seta Fluor、DyLight Fluorなど、光退色に対する耐性を示すより堅牢な蛍光色素を選択することもできます [ 2 ]
LSAB法 の基本概念：ストレプトアビジン-酵素複合体を用いて、一次抗体に結合したビオチン化二次抗体を同定する。この方法は、ABC法におけるアビジン-ビオチン複合体が大きくなりすぎる場合に適用可能である。免疫蛍光法を使用する際に発生する可能性のあるその他の問題には、自家蛍光 、スペクトル重複、および非特異的染色が含まれます。[ 1 ] [ 2 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 1 ] 、過酸化水素前処理とカタラーゼ阻害剤3-ATの組み合わせで大幅に減少することがわかりました。[ 20 ]
進歩 免疫蛍光法の主な改良点は、蛍光色素と蛍光顕微鏡の開発にある。蛍光色素は、スペクトル特性と細胞透過性を維持しながら、明るさと光安定性を向上させるために構造的に改変することができる。[ 21 ]
抗IgA抗体を用いた直接免疫蛍光 染色用に作製したヒト皮膚の組織切片 の顕微鏡写真。この皮膚はヘノッホ・シェーンライン紫斑 病患者のものである。表層の小さな毛細血管の壁にはIgA沈着が見られる（黄色の矢印）。上部の淡い波状の緑色の部分は表皮 、下部の線維状の部分は真皮 である。 超解像蛍光顕微鏡法は、 回折限界 によって制限される顕微鏡よりも高解像度の画像を生成することができます。これにより、細胞内の構造の詳細を決定することが可能になります。[ 22 ] STED ）顕微鏡、飽和構造化照明顕微鏡（SSIM）、蛍光光活性化局在顕微鏡（F PALM ）、確率的光学再構成顕微鏡（STORM）などがあります。[ 23 ]
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