誘導多能性幹細胞

人工多能性幹細胞（ iPS細胞またはiPSCとも呼ばれる）は、体細胞から直接生成できる多能性 幹細胞の一種です。iPSC技術は、京都の山中伸弥博士と高橋一俊博士によって開発されました。2人は2006年に、転写因子をコードする4つの特定の遺伝子（Myc、Oct3/4、Sox2、Klf4）（総称して山中因子）を導入することで、体細胞を多能性幹細胞に変換できることを示しました。 ^{[1]山中伸弥博士は、}ジョン・ガードン卿とともに「成熟細胞を再プログラムして多能性細胞にすることができるという発見」により、2012年のノーベル賞を受賞しました。^[2]

多能性幹細胞は再生医療の分野で有望視されています。^[3]多能性幹細胞は無限に増殖することができ、また体内のあらゆる細胞種（神経細胞、心臓細胞、膵臓細胞、肝臓細胞など）を生み出すことができるため、損傷や病気で失われた細胞を置き換えるために使用できる単一の細胞源となります。

最もよく知られている多能性幹細胞は胚性幹細胞です。しかし、胚性幹細胞の生成には着床前段階の胚の破壊（または少なくとも操作）^{[4]が伴うため、その使用をめぐっては多くの}論争がありました。現在では、患者に適合した胚性幹細胞株は、体細胞核移植（SCNT）を使用して生成することができます。^[要出典]

iPSC は成人の組織から直接抽出できるため、胚を必要とせず、患者に合わせた方法で作成できるため、各個人が独自の多能性幹細胞株を持つことができます。これらの無制限の自己細胞供給は、免疫拒絶のリスクなしに移植を作成するために使用できます。iPSC 技術はまだ治療移植が安全であるとみなされる段階には進んでいませんが、iPSC はパーソナライズされた創薬の取り組みや、患者固有の疾患の基礎を理解するためにすぐに使用されています。^[5]

山中氏はiPodなどの製品の人気にちなんでiPSCに小文字の「i」という名前を付けた。 ^{[6] [7] [8] [9]}

山中氏はノーベル賞セミナーで、細胞運命を筋肉系統に再プログラムするミオブラスト決定タンパク質1 （MyoD）の役割に関するハロルド・ワイントローブ氏の初期の独創的な研究をiPSCの発見の重要な前兆として引用した。^[10]

iPSC は通常、特定の多能性関連遺伝子セット、または「再プログラミング因子」の産物を特定の細胞タイプに導入することによって生成されます。再プログラミング因子の元のセット (山中因子とも呼ばれます) は、転写因子Oct4 (Pou5f1)、Sox2、Klf4およびcMycです。この組み合わせは iPSC の生成において最も一般的ですが、各因子は、関連する転写因子、miRNA、小分子、または系統指定子などの関連のない遺伝子によって機能的に置き換えることができます。^[11]また、C-MYC/L-MYC などの有糸分裂促進因子や、p53 などの細胞周期チェックポイントの抑制が、iPSC の再プログラミングに適した細胞状態を作成するための導管であることは明らかです。^[12]

iPSC の誘導は、通常、マウス細胞で 1 ～ 2 週間、ヒト細胞で 3 ～ 4 週間かかり、効率は 0.01 ～ 0.1% 程度と、時間がかかり、非効率的なプロセスです。しかし、iPSC の取得にかかる効率と時間の改善には、かなりの進歩がありました。再プログラミング因子の導入により、細胞は多能性幹細胞に似たコロニーを形成し始め、その形態、増殖を選択する条件、または表面マーカーやレポーター遺伝子の発現に基づいて分離できます。

人工多能性幹細胞は、2006年に京都大学の山中伸弥教授と高橋一俊教授によって初めて生成されました。[ 1 ]^彼らは、胚性幹細胞（ESC）の機能に重要な遺伝子が、成体細胞に胚状態を誘導できるのではないかと仮説を立てました。彼らは、ESCで重要であることが以前に特定されていた24個の遺伝子を選択し、レトロウイルスを使用してこれらの遺伝子をマウス線維芽細胞に送達しました。線維芽細胞は、ESC特異的遺伝子Fbx15を再活性化する細胞を抗生物質選択を使用して分離できる ように設計されました。

24 個の因子すべてが送達されると、Fbx15 レポーターを再活性化し、無限に増殖できる ESC 様コロニーが出現しました。再プログラミングに必要な遺伝子を特定するために、研究者らは 24 個のプールから因子を 1 つずつ除去しました。このプロセスにより、研究者らは Oct4、Sox2、cMyc、Klf4 の 4 つの因子を特定しました。これらの因子はそれぞれ必要であり、Fbx15 の再活性化の選択下で ESC 様コロニーを生成するのに十分でした。

2007 年 6 月、山中氏らの研究グループ、ハーバード大学とカリフォルニア大学ロサンゼルス校の共同研究グループ、およびMITのグループを含む 3 つの別々の研究グループが、再プログラミング手法を大幅に改善し、ES 細胞と区別がつかない iPSC を生み出す研究を発表しました。第一世代の iPSC とは異なり、この第二世代の iPSC は生存可能なキメラ マウスを生み出し、マウスの生殖細胞系列に寄与し、多能性幹細胞の「ゴールド スタンダード」を達成しました。

これらの第2世代iPSCは、レトロウイルスを介した同じ4つの転写因子（Oct4、Sox2、cMyc、Klf4）の発現によってマウス線維芽細胞から誘導された。しかし、多能性細胞を選択するためにFbx15を使用する代わりに、研究者らはESCで機能的に重要な遺伝子であるNanogを使用した。この異なる戦略を使用することで、研究者らは機能的にESCと同一のiPSCを作成した。^{[13] [14] [15] [16]}

ヒト細胞をiPSCにリプログラミングすることは、2007年11月に2つの独立した研究グループによって報告されました。iPSC法の先駆者である京都大学の山中伸弥氏と、ヒト胚性幹細胞を初めて誘導したウィスコンシン大学マディソン校のジェームズ・トムソン氏です。マウスのリプログラミングと同じ原理で、山中氏のグループはレトロウイルスシステムを使用して、同じ4つの重要な遺伝子、Oct4、Sox2、Klf4、cMycを持つiPSCにヒト線維芽細胞を変換することに成功しました。^{[17 ]一方、トムソン氏らは}レンチウイルスシステムを使用して、異なる因子セット、Oct4、Sox2、Nanog、Lin28を使用しました。^[18]

iPSCを生成するための線維芽細胞を得るには皮膚生検が必要であり、よりアクセスしやすい細胞の種類を特定する動きが進んでいます。^{[19] [20]} 2008年には、iPSCはヒトのケラチノサイトから得られ、これは一本の毛髪から得ることができました。^{[21] [22]} 2010年には、iPSCは末梢血細胞から得られ、^{[23] [24]} 2012年には、iPSCは尿中の腎上皮細胞から作られました。^[25]

開始細胞の種類に関するその他の考慮事項としては、突然変異負荷（例えば、皮膚細胞は紫外線曝露によりより多くの突然変異を抱える可能性がある）^{[19] [20]} 、開始細胞の集団を拡大するのにかかる時間^[19]、および特定の細胞型に分化する能力^{[26]などが挙げられる。}

^[要出典]

誘導多能性細胞の生成は、誘導に使用される転写因子に大きく依存します。

Oct-3/4およびSox 遺伝子ファミリーの特定の産物(Sox1、Sox2、Sox3、および Sox15) は、誘導プロセスに関与する重要な転写制御因子であることが確認されており、これらが存在しないと誘導は不可能になります。ただし、Klf ファミリーの特定のメンバー(Klf1、Klf2、Klf4、および Klf5)、Myc ファミリー(c-myc、L-myc、および N-myc)、Nanog、およびLIN28などの追加の遺伝子は、誘導効率を高めることが確認されています。

• Oct-3/4 (Pou5f1) Oct-3/4 は、オクタマー (「Oct」) 転写因子ファミリーの 1 つであり、多能性の維持に重要な役割を果たします。Oct-3/4 が、割球や胚性幹細胞など^{の Oct-3/4 +細胞に存在しないと、自発的な栄養}膜分化につながり、Oct-3/4 が存在すると、胚性幹細胞の多能性と分化能力が生じます。Oct-3/4 の近縁遺伝子であるOct1およびOct6を含む「Oct」ファミリーの他のさまざまな遺伝子は誘導を引き出せないため、Oct-3/4 が誘導プロセスにのみ存在することがわかります。Schöler は、再プログラミング中の Oct4 の過剰発現がエピジェネティックな変化を引き起こし、iPSC の品質を低下させることを示しました。 OSKM（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）と比較すると、新しいSKM（Sox2、Klf4、c-Myc）リプログラミングは、四倍体胚補完を通じて全iPSCマウスを生成する能力によって決定されるように、胚性幹細胞と同等の発達能を持つiPSCを生成します。 ^{[27] [28]}キメラSox因子を使用してOct4とSox2の二量体化を強化することによっても、より高い発達能を持つiPSCを生成することができます。 ^[29]
• Sox ファミリー: Sox ファミリーの転写因子は Oct-3/4 と同様に多能性の維持に関係していますが、多能性幹細胞でのみ発現する Oct-3/4 とは対照的に、多能性幹細胞と単能性幹細胞に関係しています。Sox2 はYamanakaら、Jaenisch ら、および Thomson らによって誘導に使用された最初の遺伝子でしたが、Sox ファミリーの他の転写因子も誘導プロセスで同様に機能することがわかっています。Sox1はSox2 と同様の効率で iPSC を生成し、遺伝子Sox3、 Sox15、およびSox18も iPSC を生成しますが、効率は低下します。Velychko らは、マウス、ヒト、カニクイザル、ブタ、およびウシの iPSC の生成を強化または可能にするキメラ スーパー リプログラミング因子 Sox2-17 または「スーパー Sox」を設計しました。 ^[29]
• Klf ファミリー:転写因子の Klf ファミリーのKlf4 は、最初に Yamanaka らによって特定され、Jaenisch らによってマウス iPS 細胞の生成因子として確認され、Yamanaka らによってヒト iPS 細胞の生成因子として実証されました。しかし、Thomson らは、Klf4 はヒト iPS 細胞の生成には不要であり、実際にヒト iPS 細胞を生成できなかったと報告しました。Klf2 と Klf4 は iPS 細胞を生成できる因子であることが判明し、関連遺伝子の Klf1 と Klf5 も同様に、効率は低下しましたが、iPS 細胞を生成できました。
• Myc ファミリー: Myc ファミリーの転写因子は、がんに関係するプロトオンコジーンです。Yamanaka らと Jaenisch らは、c-myc がマウス iPS 細胞の生成に関係する因子であることを実証し、Yamanaka らは、c-myc がヒト iPS 細胞の生成に関係する因子であることを実証しました。しかし、Thomson ら、Yamanaka らが iPS 細胞の誘導に「myc」ファミリーの遺伝子を使用することは、c-myc 誘導 iPS 細胞を移植したマウスの 25% に致死性の奇形腫が発生したことから、iPS 細胞を臨床治療として利用することには問題があります。N - mycとL-myc は、同様の効率で c-myc の代わりに誘導することが確認されています。
• Nanog : 胚性幹細胞において、NanogはOct-3/4やSox2とともに多能性を促進するために必要です。そのため、ThomsonらはNanogを因子の一つとしてiPS細胞を生成することが可能であると報告しているにもかかわらず、Yamanakaらは誘導にNanogは不要であると報告したことは驚きでした。
• LIN28：LIN28は分化と増殖に関連する胚性幹細胞と胚性癌細胞で発現するmRNA結合タンパク質^[30]である。Thomsonらは、 LIN28がOCT4、SOX2、NANOGと組み合わせてiPSC生成の因子であることを実証した。 ^[18]
• Glis1 : Glis1はOct-3/4、Sox2、Klf4と組み合わせて多能性を誘導できる転写因子です。C-mycの代わりに使用すると多くの利点があります。 ^[31]

山中氏らが開拓した手法により、成体細胞をiPS細胞に再プログラムできることが実証されましたが、この技術には依然として課題が残っています。

1. 効率の低さ: 一般的に、iPS 細胞への変換は信じられないほど低い。例えば、山中氏の最初のマウス研究では、体細胞が iPS 細胞に再プログラムされた率は 0.01～0.1% だった。 ^[1]効率の低さは、再プログラム遺伝子の正確なタイミング、バランス、および絶対的な発現レベルの必要性を反映している可能性がある。また、元の体細胞集団または長期培養において、まれな遺伝的またはエピジェネティックな変化が必要であることを示唆している可能性もある。しかし、最近、ヌクレオソームリモデリングおよび脱アセチル化 ( NuRD ) 複合体のダウンレギュレーションを必要とする効率的な再プログラム化の方法が発見された。NuRD のサブユニットである Mbd3 の過剰発現は、iPSC の誘導を阻害する。一方、Mbd3 の枯渇は再プログラム化の効率を改善し、^[32]決定論的かつ同期した iPS 細胞の再プログラム化をもたらす (マウスおよびヒト細胞から 7 日以内にほぼ 100% の効率)。^[33]
2. ゲノム挿入：転写因子のゲノム統合は、標的細胞のゲノムに突然変異が挿入されるリスクがあるため、転写因子アプローチの有用性を制限します。^[34]ゲノム挿入を回避するための一般的な戦略は、入力に別のベクターを使用することです。プラスミド、アデノウイルス、トランスポゾンベクターはすべて研究されてきましたが、これらはスループットが低下するというトレードオフを伴うことがよくあります。^{[35] [36] [37]}
3. 腫瘍形成性: 使用される方法によっては、iPSC を得るための成体細胞の再プログラム化は、ヒトでの使用を制限する重大なリスクをもたらす可能性がある。例えば、ウイルスを使用して細胞のゲノムを変更すると、がん遺伝子(がんを引き起こす遺伝子) の発現が引き起こされる可能性がある。2008 年 2 月、科学者は多能性誘導後にがん遺伝子を除去できる技術の発見を発表し、これによりヒトの疾患における iPS 細胞の潜在的使用が増加した。^[38]別の研究で、山中はがん遺伝子 c-Myc なしで iPSC を作成できることを報告した。このプロセスには時間がかかり、効率も低かったが、結果として得られたキメラはがんを発症しなかった。^[39]がんの重要な調節因子である腫瘍抑制因子 p53 を不活性化または削除すると、再プログラム化の効率が大幅に向上する。^[40]したがって、再プログラム化の効率と腫瘍生成の間にはトレードオフがあるようだ。
4. 不完全な再プログラミング：再プログラミングは完全性という課題にも直面しています。これは特に難しい課題です。なぜなら、細胞を完全に再プログラミングするには、ゲノム全体のエピジェネティック コードをターゲット細胞の種類に合わせて再フォーマットする必要があるからです。しかし、3 つの別々のグループが、マウス胚線維芽細胞(MEF) 由来の iPS 細胞を発見し、これを四倍体 胚盤胞に注入してiPS 細胞のみからマウスを誕生させることに成功しました。これにより、多能性に関して胚性幹細胞 (ESC) と iPS が同等であるかどうかの議論は終わりました。^[41]

右の表は、2006 年に山中らが画期的な成果をあげて以来、最初の 5 年間に iPS 細胞を開発するために使用された主要な戦略と技術をまとめたものです。同じ色の行は、再プログラミングに同様の戦略を使用した研究を表しています。

問題 (1) と (2) を回避するための主な戦略の 1 つは、転写因子の効果を模倣できる小分子を使用することです。これらの化合物は、ゲノムを効果的にターゲットにしない、または別の理由で再プログラミングに失敗した再プログラミング因子を補うことができるため、再プログラミング効率が向上します。また、場合によっては腫瘍形成に寄与するゲノム統合の問題も回避できます。このような戦略を使用した重要な研究は 2008 年に実施されました。Melton らは、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC) 阻害剤バルプロ酸の効果を検討しました。彼らは、それが再プログラミング効率を 100 倍増加させることを発見しました (山中の従来の転写因子法と比較して)。^{[42]研究者らは、この化合物が転写因子 c-Myc によって通常引き起こされるシグナル伝達を模倣していると提案しました。同様のタイプの補償メカニズムが}Sox2の効果を模倣するために提案されました。2008 年に、Ding らは、再プログラミング効率を高めるために、BIX-01294によるヒストンメチルトランスフェラーゼ（HMT）の阻害と細胞膜のカルシウムチャネルの活性化を組み合わせた。 ^[43]北京大学のDengらは、2013年7月に、遺伝子組み換えなしで人工多能性幹細胞を作成できることを報告した。彼らは、DZNepを含む7つの小分子化合物のカクテルを使用して、マウスの体細胞を幹細胞に誘導し、その効率は0.2％で、標準的なiPSC生成技術を使用した場合と同等でした。CiPS細胞は発生中のマウス胚に導入され、すべての主要な細胞タイプに寄与することがわかり、その多能性が証明されました。^{[44] [45]}

ディンらは、薬物のような化学物質の使用による転写因子の再プログラミングの代替手段を実証した。線維芽細胞を幹細胞のような状態に押し上げる間葉系上皮転換（MET）プロセスを研究することにより、ディンらのグループは、ALK5阻害剤SB431412とMEK（ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤PD0325901という2つの化学物質を特定し、これらが古典的な遺伝学的方法の効率を100倍に高めることが判明した。細胞生存経路に関与することが知られている3番目の化合物を加えると、チアゾビビンは効率をさらに200倍に高める。これら3つの化合物の組み合わせを使用することで、ヒト線維芽細胞の再プログラミングプロセスも4週間から2週間に短縮された。^{[46] [47]}

2009年4月、成体細胞の遺伝子改変なしにiPS細胞の生成が可能であることが実証されました。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に特定のタンパク質を繰り返し注入することで、多能性を誘導するのに十分でした。^[48]これらのiPSCの頭字語はpiPSC（タンパク質誘導多能性幹細胞）です。

腫瘍形成やスループットの低下などの問題を回避するためのもう 1 つの重要な戦略は、アデノウイルス、プラスミド、裸の DNA またはタンパク質化合物など、 代替形式のベクターを使用することです。

2008年、Hochedlingerらはアデノウイルスを使用して、必要な4つの転写因子をマウスの皮膚細胞と肝臓細胞のDNAに輸送し、ES細胞と同一の細胞を作成しました。アデノウイルスは、自身の遺伝子を標的の宿主に組み込まず、挿入変異の可能性を回避するため、ウイルスやレトロウイルスなどの他のベクターとは異なります。^[43] 2009年、Freedらは、ヒト線維芽細胞をiPS細胞に再プログラムすることに成功しました。^[49]アデノウイルスを使用するもう1つの利点は、効果的な再プログラムを行うために、短時間存在するだけでよいことです。

また、2008年に山中らは、必要な4つの遺伝子をプラスミドで導入できることを発見した。^[35]山中らは、再プログラム化因子を含む2つのプラスミド構築物をトランスフェクションすることで、マウス細胞の再プログラム化に成功した。最初のプラスミドはc-Mycを発現し、2番目は他の3つの因子（Oct4、Klf4、およびSox2）を発現した。プラスミド法はウイルスを避けているが、再プログラム化を達成するためには依然として癌促進遺伝子が必要である。これらの方法のもう1つの主な問題は、レトロウイルス法に比べて効率がはるかに低い傾向があることである。さらに、トランスフェクトされたプラスミドは宿主ゲノムに組み込まれることが示されており、したがって、挿入変異のリスクが依然として存在する。非レトロウイルスアプローチはそのような低い効率レベルを示したため、研究者らはPiggyBacトランスポゾンシステムとして知られるものを使用して、この技術を効果的に救済しようと試みてきた。いくつかの研究により、このシステムは宿主細胞のゲノムに変異の痕跡を残さずに重要な再プログラミング因子を効果的に送達できることが実証されています。PiggyBac トランスポゾン システムでは、外来遺伝子の再切除が行われるため、挿入変異の問題は発生しません。^{[引用が必要]}

2014年1月、ある種の多能性幹細胞は、細胞を特定の種類のストレス（細菌毒素、5.7の低pH、または物理的な圧迫）にさらすことで生成できると主張する2つの論文が発表されました。生成された細胞は、刺激誘発多能性獲得（stimulus-triggered acquirement of pluripotency）を意味するSTAP細胞と呼ばれました。^[50]

他の研究室がこの驚くべき研究結果を再現するのに困難を伴ったことを考慮して、2014年3月、共著者の一人が論文の撤回を求めた。^[51] 2014年6月4日、筆頭著者の小保方氏は、 2014年4月1日の理化学研究所の調査で「研究不正行為」を犯したことが判明した後、両方の論文を撤回することに同意した^。[53]

マイクロRNAは、メッセンジャーRNAの相補配列に結合し、遺伝子の発現を阻害する短いRNA分子である。iPS細胞におけるマイクロRNA発現の変動を測定することで、分化能を予測することができる。^[54]マイクロRNAの添加は、iPS能を高めるためにも使用できる。いくつかのメカニズムが提案されている。^[54] ES細胞特異的マイクロRNA分子（miR-291、miR-294、miR-295など）は、c-Mycの下流に作用することで誘導多能性の効率を高める。^[55]マイクロRNAは、山中の4つの転写因子のリプレッサーの発現を阻害することもでき、外因性転写因子を添加しなくても再プログラミングを誘導する追加のメカニズムが存在する可能性がある。^[54]

誘導多能性幹細胞は、特定の幹細胞遺伝子やタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、および効力と分化可能性など、多くの点で胚性幹細胞などの天然多能性幹細胞と類似していますが、天然多能性幹細胞との関係の全容はまだ評価中です。^[1]

ES細胞とiPS細胞では、遺伝子発現とゲノム全体のH3K4me3およびH3K27me3が非常に類似していることが判明しました。 ^{[56] [要出典]}生成されたiPSCは、以下の点で自然に分離された多能性幹細胞（それぞれマウスおよびヒト胚性幹細胞、mESCおよびhESCなど）と非常に類似しており、iPSCが自然に分離された多能性幹細胞と同一性、信頼性、多能性を持つことが確認されました。

• 細胞の生物学的特性
  • 形態：iPSC は形態的に ESC に類似しています。各細胞は丸い形をしており、核小体が大きく、細胞質はわずかです。iPSC のコロニーも ESC のコロニーに類似しています。ヒト iPSC は hESC に類似した、鋭角で平らで密集したコロニーを形成し、マウス iPSC は mESC に類似した、hESC よりも平らではなく凝集したコロニーを形成します。
  • 成長特性: 倍加時間と有糸分裂活性は ESC の基礎であり、幹細胞はその定義の一部として自己複製する必要があります。iPSC は有糸分裂活性があり、活発に自己複製し、増殖し、ESC と同等の速度で分裂していました。
  • 幹細胞マーカー: iPSC は ESC 上に発現する細胞表面抗原マーカーを発現しました。ヒト iPSC は SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Nanog など hESC に特有のマーカーを発現しました。マウス iPSC は mESC と同様に SSEA-1 を発現しましたが、SSEA-3 や SSEA-4 は発現しませんでした。
  • 幹細胞遺伝子: iPSC は、Oct-3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4、hTERT など、未分化 ESC で発現する遺伝子を発現しました。
  • テロメラーゼ活性:テロメラーゼは、ヘイフリック限界の約 50 回の細胞分裂に制限されない細胞分裂を維持するために必要です。hESC は自己複製と増殖を維持するために高いテロメラーゼ活性を示し、ヒト iPSC も高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体に必要な成分である hTERT (ヒトテロメラーゼ逆転写酵素) を発現します。
• 多能性: iPSC は、ESC と同様の方法で完全に分化した組織に分化することができました。
  • 神経分化：iPSC はニューロンに分化し、βIII-チューブリン、チロシン水酸化酵素、AADC、DAT、ChAT、LMX1B、MAP2 を発現しました。カテコールアミン関連酵素の存在は、iPSC が hESC と同様にドーパミン作動性ニューロンに分化可能であることを示している可能性があります。幹細胞関連遺伝子は分化後にダウンレギュレーションされました。
  • 心臓分化: iPSC は心筋細胞に分化し、自発的に拍動を始めました。心筋細胞は TnTc、MEF2C、MYL2A、MYHCβ、および NKX2.5 を発現しました。幹細胞関連遺伝子は分化後にダウンレギュレーションされました。
  • 奇形腫の形成:免疫不全マウスに注入された iPSC は、 9 週間後に自発的に奇形腫を形成しました。奇形腫は、3 つの胚葉 (内胚葉、中胚葉、外胚葉)に由来する組織を含む複数の系統の腫瘍です。これは、通常 1 つの細胞タイプのみからなる他の腫瘍とは異なります。奇形腫の形成は、多能性を調べるための画期的なテストです。
  • 胚様体: 培養された hESC は、自発的に「胚様体」と呼ばれる球状の胚様構造を形成します。これは、有糸分裂が活発で分化中の hESC の核と、3 つの胚葉すべてから完全に分化した細胞の周辺部で構成されます。iPSC も胚様体を形成し、周辺部に分化した細胞があります。
  • キメラマウス：ヒトES細胞は、本来は胚盤胞の内部細胞塊（胚芽細胞）内に存在し、胚芽細胞では胚に分化し、胚盤胞の殻（栄養芽細胞）は​​胚体外組織に分化します。中空の栄養芽細胞は生きた胚を形成できないため、胚芽細胞内の胚性幹細胞が分化して胚を形成する必要があります。iPSCをマイクロピペットで栄養芽細胞に注入し、胚盤胞を受容雌に移植しました。キメラの生きたマウスの子が作られました。これは、10～90%のキメリズムで全身にiPSC誘導体が組み込まれたマウスです。
  • 四倍体補完：マウス胎児線維芽細胞由来のiPS細胞を四倍体胚盤胞（それ自体は胚体外組織しか形成できない）に注入すると、キメラではない生殖能力のあるマウスを形成できるが、成功率は低い。^{[41] [57] [58]}多能性幹細胞株を、改変したSox2およびKlf4をコードするエピソームプラスミド（SKカクテル）に短時間さらすことで、全PSCマウス生産の効率を高めることができる。^[29]
• エピジェネティック再プログラミング
  • プロモーター脱メチル化: メチル化は DNA 塩基へのメチル基の転移であり、通常はCpG サイト(隣接するシトシン/グアニン配列) のシトシン分子へのメチル基の転移です。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性を阻害するか、発現を阻害する酵素をリクルートすることによって、発現を阻害します。したがって、遺伝子のメチル化は、転写を阻害することによって遺伝子を効果的にサイレンシングします。Oct-3/4、Rex1、Nanog などの多能性関連遺伝子のプロモーターは iPSC で脱メチル化され、そのプロモーター活性と、iPSC での多能性関連遺伝子の活発な促進と発現が実証されました。
  • DNAメチル化の全体的変化: ヒトiPS細胞は、シトシンがメチル化されるパターンが他のどの細胞種よりもES細胞と非常に類似している。しかし、複数のiPS細胞株では約1000箇所に違いが見られる。これらの半分はiPS細胞が由来する体細胞株に類似しており、残りはiPSCに特有のものである。iPS細胞がES細胞の状態に再プログラムされない、メガベースサイズの数十の領域も発見されている。^[59]
  • ヒストンの脱メチル化:ヒストンは、DNA 配列に構造的に局在する圧縮タンパク質であり、さまざまなクロマチン関連の修飾を通じてその活性に影響を与える可能性があります。Oct-3/4、Sox2、および Nanog に関連する H3 ヒストンは脱メチル化されており、Oct-3/4、Sox2、および Nanog の発現を示しています。

• iPSCの臨床応用の可能性に関する主な懸念は、腫瘍形成の傾向です。^[60] ESCと同様に、iPSCは免疫不全マウスに注入されると容易に奇形腫を形成します。奇形腫の形成は、FDAによって幹細胞に基づく再生医療の大きな障害と見なされています。
• マウスの脊髄損傷後の運動機能回復に関する最近の研究では、ヒト誘導多能性幹細胞をマウスに移植した後、細胞が脊髄で3つの神経系統に分化することが示されました。細胞は損傷した脊髄の再生を刺激し、髄鞘形成を維持し、シナプスを形成しました。これらの肯定的な結果は、脊髄損傷後112日以上にわたって腫瘍形成なしに観察されました。^[61]しかし、同じグループによる追跡調査では、ヒト誘導多能性幹細胞の明確なクローンが最終的に腫瘍を形成することが示されました。^[62]
• iPSC は現時点では改変によってのみ高効率で生成できるため、一般的に hESC よりも安全性が低く、腫瘍形成性が高いと予測されています。iPSC の形成を促進することが示されているすべての遺伝子は、何らかの形で癌にも関連しています。遺伝子の中には、Myc ファミリーのメンバーを含む既知の癌遺伝子があります。Myc を省略しても iPSC の形成は可能ですが、効率は最大 100 倍低下します。
• 遺伝子を使わないiPSC製造法は組み換えタンパク質を用いて実証されているが、その効率は非常に低いものであった。^[48]しかし、この方法論を改良して効率を高めることで、より安全なiPSCが製造されるようになるかもしれない。アデノウイルスやプラスミドを使用するなどの他のアプローチは、一般的にレトロウイルス法よりも安全であると考えられている。
• iPSC分野における今後の重要な研究分野は、再生医療療法に使用されるアプローチを模倣した方法を使用してiPSCの腫瘍形成性を直接テストすることです。iPSCは奇形腫を形成するだけでなく、iPSCから生成されたマウスは悪性癌による死亡率が高いため、このような研究は非常に重要です。^[63] 2010年にStem Cells誌にiPS細胞はESCよりもはるかに腫瘍形成性が高いことを示す論文が発表され、iPS細胞の安全性が深刻な懸念事項であるという考えを裏付けています。^[64]
• IPS細胞の免疫原性に関する懸念は、2011年にZhouらが奇形腫形成アッセイを含む研究を行い、IPS細胞が細胞拒絶を引き起こすほど強力な免疫反応を生じることを実証したときに浮上した。しかし、同様の手順を遺伝的に同等のES細胞で実行したところ、Zhouらは奇形腫を発見し、これは細胞が免疫系に許容されることを示した。^[65] 2013年にArakiらは、Zhouらが得た結論を別の手順で再現しようとした。彼らは、IPSCクローンとマウス胚から成長したキメラから細胞を採取し、この組織を同系マウスに移植した。彼らは、IPSCクローンの代わりにES細胞を使用して同様の試験を実施し、結果を比較した。調査結果によると、IPS細胞とES細胞によって生じる免疫原性反応には有意差がなかった。さらに、Arakiらは、両方の細胞株に対して免疫原性反応はほとんどないか、全くないと報告した。^[66]したがって、荒木らは周らと同じ結論に達することができなかった。

iPS細胞を作製するという作業は、上記6つの問題のため、依然として困難な課題である。克服すべき重要なトレードオフは、効率とゲノム統合との間のトレードオフである。トランスジーンの統合に依存しない方法のほとんどは非効率的であるが、トランスジーンの統合に依存する方法は、不完全な再プログラミングと腫瘍形成の問題に直面しているが、膨大な数の技術と方法が試みられてきた。もう1つの大きな戦略セットは、iPS細胞のプロテオーム特性評価を行うことである。^[58]さらなる研究と新しい戦略により、5つの主な課題に対する最適な解決策が生まれるはずである。1つのアプローチは、これらの戦略の肯定的な特性を組み合わせて、細胞をiPS細胞に再プログラミングするための究極的に効果的な技術を試みることである。

もう一つのアプローチは、患者由来のiPS細胞を使用して、表現型を救済できる治療薬を特定することである。例えば、p63遺伝子が変異している外胚葉異形成症候群（EEC）に罹患した患者由来のiPS細胞株は、小さな化合物によって部分的に救済できる異常な上皮コミットメントを示す。^[67]

ヒトiPS細胞の魅力は、成人患者から採取してヒト疾患の細胞基盤を研究できることである。iPS細胞は自己複製能と多能性を備えているため、理論的には患者由来の細胞の無限の供給源となり、体内のあらゆるタイプの細胞に変えることができる。患者由来の他の多くのタイプのヒト細胞は、実験室培養で数回継代すると成長が止まる傾向があるため、これは特に重要である。iPS細胞は、ダウン症候群や多発性嚢胞腎などの一般的な疾患を含む、多種多様なヒト遺伝疾患に対して生成されてきた。^{[68] [69] [70]}多くの場合、患者由来のiPS細胞は、健康な被験者のiPS細胞には見られない細胞欠陥を示し、疾患の病態生理学への洞察を提供している。^{[71] [72]}国際協力プロジェクトであるStemBANCCは、さまざまな疾患の薬剤スクリーニング用のiPS細胞株のコレクションを構築するために2012年に設立された。オックスフォード大学が管理するこのプロジェクトは、10社の製薬会社と23の大学から資金とリソースを集めて実施された。目標は、ヒトの疾患環境をシミュレートすることで、早期の薬物試験に使用される1,500種のiPS細胞株のライブラリーを作成することである。^[73]さらに、hiPSC技術と小分子または遺伝子組み換えの電圧およびカルシウム指標を組み合わせることで、心血管薬物安全性スクリーニングのための大規模で高スループットのプラットフォームが提供された。^{[74] [75] [76] [77] [78]}

人工多能性幹細胞（iPSC）を使用して移植用のヒト臓器を生成する概念実証が、日本の研究者によって報告されました。ヒトの「肝芽」（iPSC-LB）は、 iPSCから誘導された肝細胞（肝機能用）、臍帯血からの内皮幹細胞（血管の内層を形成）、および間葉系幹細胞（結合組織を形成）の3種類の幹細胞の混合物から成長しました。この新しいアプローチにより、異なる細胞タイプが複雑な臓器に自己組織化され、胎児の発達のプロセスを模倣できます。数日間体外で成長した後、肝芽はマウスに移植され、そこで「肝臓」はすぐに宿主の血管と結合し、成長を続けました。最も重要なことは、薬物の代謝や肝臓特有のタンパク質の生成など、通常の肝臓機能を実行したことです。今後の研究では、移植された臓器が宿主の体内でどのくらいの寿命をたどるか（統合する能力や拒絶反応を回避する能力）や、腫瘍に変化するかどうかが監視される予定である。^{[79] [80]}

2021年には、腫瘍形成なしに損傷した心臓を再生するための切り替え可能な山中因子再プログラミングに基づくアプローチがマウスで実証され、心臓発作の直前または直後に介入を実施した場合に成功した。^[81]

胚性臍帯血細胞はプラスミドDNAを用いて多能性幹細胞に誘導された。細胞表面の内皮細胞/周皮細胞マーカーCD31とCD146を用いて、研究者らは高品質で多能性の血管幹細胞である「血管前駆細胞」を特定した。iPS細胞をマウスの損傷した網膜の硝子体に直接注入すると、網膜に移植された幹細胞は成長し、血管を修復した。^{[82] [83]}

脳損傷のある実験動物に注入された標識iPSC由来NSCは損傷部に移動し、運動機能の改善が観察された。^[84]

拍動する心筋細胞であるiPSC由来心筋細胞は、化学的に定義された分化プロトコルを使用して大量生産することができます。^{[85] [86]}これらのプロトコルは通常、心臓の発達に必要な同じ発達シグナル伝達経路を調節します。^[87]これらのiPSC心筋細胞は、由来した患者と同じ遺伝的背景を示すため、遺伝性不整脈や心臓薬物反応を再現することができます。 ^{[88] [89] [90] [91]}

タカラバイオは2014年6月、京都大学iPS細胞研究所発のベンチャー企業であるiHeart Japanから技術移転を受け、iPS細胞から心筋細胞への分化誘導技術と特許をアジアで独占的に使用できるようになった。同社は、心臓病の新薬開発に役立ててもらうため、製薬会社や大学に心筋細胞を販売する考えを発表した。^[92]

大阪大学の特定再生医療等委員会は2018年3月9日、iPS細胞から作った「心筋シート」を重症心不全患者の心臓に移植する世界初の臨床研究計画を正式に承認した。大阪大学は同日、厚生労働省に申請したと発表した。

2018年5月16日、条件付きで厚生労働省の専門家会議により臨床研究計画が承認された。^{[93] [94]}

2019年10月、岡山大学のグループはiPS細胞から分化させた心筋細胞を用いた虚血性心疾患モデルを開発した。^[95]

献血された血液1パイントには約2兆個の赤血球が含まれており、世界中で1億700万回以上の献血が行われているが、輸血用の血液が依然として緊急に必要とされている。2014年、スコットランド国立血液輸血サービスでiPSCからO型 赤血球が合成された。細胞は中胚葉、血液細胞、そして赤血球になるように誘導された。最終段階では、細胞から核を排出させ、適切に成熟させる。O型はすべての患者に輸血できる。ヒト臨床試験は2016年より前には開始されないと予想されていた。^[96]

自己iPSCを使用した最初のヒト臨床試験は厚生労働省の承認を受け、2014年に神戸の理化学研究所発生・再生科学総合研究センターで実施される予定だった。しかし、2015年11月に日本の新しい再生医療法が施行された後、臨床試験は中断された。 ^[97]具体的には、既存のガイドラインが強化され、法律の効力を持つようになった（以前は単なる勧告だった）。^[98]滲出型加齢黄斑変性症の患者6人の皮膚細胞から採取したiPSCを再プログラムし、網膜色素上皮（RPE）細胞に分化させた。細胞シートは、変性したRPE組織を切除した患部の網膜に移植される。安全性と視力回復のモニタリングは1～3年続く予定だった。^{[99] [100]}

2017年3月、高橋政代氏率いる研究チームは、ドナーから採取したiPS細胞由来の網膜細胞を進行した黄斑変性症患者の眼に移植することに初めて成功した。^[101]しかし、現在、合併症が発生していると報告されている。^{[102]自己iPS細胞を使用する利点は、理論的には}拒絶反応のリスクがなく、胚性幹細胞を使用する必要がないことである。しかし、これらのiPS細胞は他人から採取されたものである。^[100]

iPSCを用いた新たな臨床試験は、日本だけでなく米国や欧州でも進行中である。^[103] 2021年に臨床試験登録機関Clinicaltrials.govで行われた調査では、iPSCに言及した試験リストが129件特定されたが、そのほとんどは非介入的なものであった。^[104]

iPSC を用いた再生医療技術をより多くの患者に提供するためには、HLAのハプロタイプに依存せずに移植できるユニバーサル iPSC を作成する必要があります。ユニバーサル iPSC を作成するための現在の戦略には、HLA の発現を除去することと、 HLA の欠失によるNK 細胞の攻撃を防ぐことという 2 つの主な目標があります。CRISPR /Cas9システムを使用したB2M遺伝子とCIITA遺伝子の欠失は、それぞれ HLA クラス I とクラス II の発現を抑制することが報告されています。NK 細胞の攻撃を回避するために、HLA-EやCD47などの NK 細胞を阻害するリガンドの導入が使用されています。^[105] HLA-Cは変更されていません。12 の一般的な HLA-C 対立遺伝子で世界の人口の 95% をカバーするのに十分だからです。^[105]

多能性間葉系幹細胞は、多能性に誘導されると、老化の表現型を遅らせたり逆転させたりすることが期待されます。このような抗老化特性は、2017年の初期臨床試験で実証されました。^[106] 2020年、スタンフォード大学の研究者は、高齢のマウスを研究した後、山中因子にさらされた古い人間の細胞は若返り、若い細胞とほとんど区別がつかなくなる可能性があると結論付けました。^[107]

• 誘導幹細胞
• 幹細胞治療
• 刺激誘発多能性細胞の獲得、細胞を酸に浸すことで多能性幹細胞が生成されるという、現在では信用できない主張
• 誘導多能性幹細胞とSCNTで得られた胚性幹細胞株（議論）
• 脱分化
• 指向性差別化
• 多能性