生命科学における蛍光

蛍光は、生命科学において、一般的には生体分子を非破壊的に追跡または分析する方法として使用されています。細胞内の一部のタンパク質または小分子は、本来蛍光を発するもので、内因性蛍光または自己蛍光と呼ばれます（ NADH、トリプトファンまたは内因性クロロフィル、フィコエリトリンまたは緑色蛍光タンパク質など）。内因性 DNA 蛍光は非常に弱いです^[1]。あるいは、特定のまたは一般的なタンパク質、核酸、脂質または小分子を、外因性蛍光体、つまり小分子、タンパク質または量子ドットである蛍光染料で「ラベル付け」することができます。蛍光体の追加特性を利用するためのいくつかの技術があります。たとえば、エネルギーが非放射的に特定の隣接染料に渡され、近接性またはタンパク質の活性化を検出できるようにする蛍光共鳴エネルギー移動です。別の方法としては、特定の染料の強度などの特性が環境に応じて変化し、構造研究に使用できるようにすることです。^{[2] [3] [4]}

蛍光の原理は、蛍光部分に電子が含まれており、電子が光子を吸収して一時的に励起状態になり、その後エネルギーを非放射的に分散するか、より低いエネルギー、つまりより長い波長で光子として放出するというものである（波長とエネルギーは反比例する）。^[5] 励起波長と放出波長の差はストークスシフトと呼ばれ、励起電子が光子を放出するのにかかる時間は寿命と呼ばれる。量子収率は染料の効率の指標であり（吸収された光子あたりの放出された光子の比率）、消衰係数は蛍光体が吸収できる光の量である。量子収率と消衰係数はどちらも各蛍光体に固有のものであり、掛け合わせると蛍光分子の明るさが計算される。^[6]

蛍光体は、次のような特定の官能基を介してタンパク質に結合できます。

• アミノ基（例えば、スクシンイミドまたはイソチオシアネート経由）
• カルボキシル基（例えば、カルボジイミドによる活性化とそれに続くアミンとのカップリングによる）
• チオール（例えば、マレイミドまたはヨードアセトアミド経由）
• アジド（例えば、末端アルキンとのクリックケミストリー経由）

または非特異的（グルタルアルデヒド）または非共有結合（例えば疎水性などを介して）で結合します。

これらの蛍光体は、小さな分子、タンパク質、または量子ドットのいずれかです。

有機蛍光体は、バンドを飛び越えて吸収されたエネルギーを安定化できる非局在化電子のおかげで蛍光を発するため、ほとんどの蛍光体は共役系です。いくつかのファミリーが存在し、その励起範囲は赤外線から紫外線に及びます。
ランタノイド（キレート化）は、禁止されている4つのf軌道を含む遷移のおかげで発光する独特の蛍光金属であり、そのため吸収係数が非常に低く、発光が遅く、蛍光有機キレート剤（例えば、 ジピコリネートベースのテルビウム（III）キレート剤^[7]）による励起が必要です。
小分子蛍光体の3番目のクラスは、遷移金属-配位子錯体のクラスであり、部分的に禁止されている金属から配位子への電荷移動状態から分子蛍光を示すもので、これらは通常、ルテニウム、レニウム、またはオスミウムの錯体です。

量子ドットは、従来の染色剤よりも明るい蛍光半導体ナノ粒子です。一般的に、量子ドットはより高価で、毒性があり、細胞膜を透過せず、細胞によって生成されません。

自然界にはさまざまな蛍光タンパク質が存在するが^[要出典]、研究ツールとして最も重要なのはクラゲのAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)である^[8]。これは、特定のセリン-チロシン-グリシン残基を介して折り畳まれると自発的に蛍光を発する。GFP やその他の蛍光タンパク質が有機色素や量子ドットよりも優れている点は、細胞内で単独で、または融合タンパク質として外因的に発現できることである。融合タンパク質は、蛍光遺伝子 (GFP など) を別の遺伝子に連結して作成され、その発現はハウスキーピング遺伝子プロモーターまたは別の特定のプロモーターによって駆動されるタンパク質である。このアプローチにより、蛍光タンパク質を、細胞内局在や発現パターンなど、さまざまな生物学的イベントのレポーターとして使用することができる。GFP のバリアントはサンゴ、具体的には花虫綱に自然に存在し、可視スペクトルにまたがり、より長く安定して蛍光を発するようにいくつかの変異体が作られている。他のタンパク質は蛍光を発しますが、蛍光体補因子を必要とするため、 in vitro でのみ使用できます。これらは植物や藻類によく見られます (植物蛍光体、アロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質)。

上記の技術は、細胞を染色せずに染色レベルを推定する計算方法と組み合わせることができます。これらのアプローチは、一般的に、深層畳み込みニューラルネットワークをトレーニングしてイメージングの再マッピングを実行し、明視野画像または位相画像を蛍光画像に変換します。^{[9] [10]}トレーニングコーパスを調査対象の細胞から切り離すことで、これらのアプローチは、抗体染色など、生細胞イメージングと互換性のない染色を使用する手段を提供します。^[11]

蛍光、化学発光、およびりん光は、3 つの異なるタイプの発光特性、すなわち物質からの光の放出です。蛍光は、光がより低いエネルギー (=より高い波長) で数ナノ秒 (約 10 ナノ秒) 以内に吸収され、放出される特性です。一方、生物発光は生物学的化学発光であり、基質上の酵素の化学反応によって光が生成される特性です。 りん光は、光を吸収し、数ミリ秒以上後にエネルギーを放出する物質の特性です (三重項状態の基底状態への禁制遷移によるのに対し、蛍光は励起一重項状態で発生します)。最近まで、無機粒子のサイズのため、これは生命科学研究には適用できませんでした。ただし、蛍光とりん光の境界は明確ではなく、金属といくつかの有機部分を組み合わせた遷移金属- 配位子錯体は寿命が最大数マイクロ秒と長いためです (混合一重項-三重項状態を示すため)。

過去 30 年間に広く使用されるようになる前は、放射能が最も一般的なラベルでした。

放射性ラベルと比較した蛍光の利点は次のとおりです。

• 蛍光はより安全に使用でき、放射線管理も必要ありません。
• 複数の蛍光分子は、それらが重複しない限り同時に使用できます（FRETを参照）。一方、放射能の場合は2つの同位体（強度が異なるためトリチウムと^33Pなどの低エネルギー同位体）を使用できますが、特別な機械（トリチウムスクリーンと通常のリン光体イメージングスクリーン、または特定のデュアルチャンネル検出器^[12]）が必要です。

注:チャネルは「色」に似ていますが、異なります。チャネルは、染料に固有の励起フィルターと発光フィルターのペアです。たとえば、Agilent マイクロアレイはデュアル チャネルで、cy3 と cy5 で動作し、口語的には緑と赤と呼ばれます。

蛍光は、専用の検出装置を必要とするため、必ずしも使いやすいとは限りません。非定量的または相対的な定量化の用途では便利ですが、蛍光消光のため絶対測定にはあまり適していません。一方、放射性標識分子の測定は常に直接的で高感度です。

蛍光体の欠点は次のとおりです。

• 蛍光標識分子の特性を大幅に変化させる
• 正常な生物学的プロセスへの干渉
• 毒性

蛍光の基本的な特性は、細胞内の標識成分のマーカー（蛍光顕微鏡）や溶液中の指標（蛍光分光法）など、幅広く使用されていますが、放射能には見られないその他の追加特性により、蛍光はさらに幅広く使用されています。

FRET (フェルスター共鳴エネルギー移動) は、ドナーと呼ばれる 1 つの蛍光体の励起電子のエネルギーが、近くのアクセプター色素 (暗色消光剤または別の蛍光体) に伝達される特性です。アクセプター色素の励起スペクトルはドナー色素の発光スペクトルと重なり、蛍光が減少することになります。これは次の目的で使用できます。

• 2 つの標識されたタンパク質または核酸が接触するか、または二重に標識された単一分子が加水分解されるかどうかを検出する。
• 構造の変化を検出する。
• 競合結合アッセイにより濃度を測定します。

環境感受性色素は、環境の極性（疎水性および電荷）に応じて特性（強度、半減期、励起および発光スペクトル）が変化します。例としては、インドール、カスケードイエロー、プロダン、ダンシル、ダポキシル、NBD、ピムポ、ピレン、ジエチルアミノクマリンなどがあります。
この変化は、電子供与基と電子吸引基が芳香族環系の反対側の端に配置された場合に最も顕著であり、^{[13]励起時に}双極子モーメントが大きく変化するためです。

蛍光体が励起されると、一般に基底状態 (μ _{G ) よりも大きな双極子モーメント (μ E} ) を持ちます。蛍光体による光子の吸収には数ピコ秒かかります。このエネルギーが放出される前に (発光: 1～10 ns)、励起一重項状態での極性の変化により、蛍光体の周囲の溶媒分子が再配向します (10～100 ps)。このプロセスは溶媒緩和と呼ばれます。この緩和の結果、蛍光体の励起状態のエネルギーは低下します (波長が長くなります)。そのため、双極子モーメントの変化が大きい蛍光体は、異なる溶媒でストークス シフトの変化が大きくなります。エネルギー レベル間の差は、Lipper-Mataga 方程式で大まかに決定できます。

疎水性染料は水に溶けない染料で、ソルバトクロミズムとは無関係の特性です。さらに、化学における環境感受性という
用語は、実際には極性だけでなく、pH や温度など、さまざまな環境要因の 1 つによる変化を表します。ただし、生化学では、環境感受性蛍光体とソルバトクロミズム蛍光体は互換的に使用されます。この慣例は非常に普及しており、サプライヤーはこれらをソルバトクロミズムよりも環境感受性として説明しています。

蛍光部分は、吸収後数ナノ秒で指数関数的減衰曲線に従って光子を放出します。この減衰曲線は染料によって異なり、周囲の溶媒に依存します。染料が高分子に結合されると、減衰曲線は多指数関数的になります。共役染料の寿命は通常 1～10 ns ですが、例外として寿命が長いものも少数存在します。特にピレンは脱気溶媒中で 400 ns、脂質中で 100 ns、コロネンは 200 ns です。蛍光体の別のカテゴリには、以前説明した蛍光有機金属 (ランタニドおよび遷移金属配位子錯体) があり、状態が制限されているため寿命がはるかに長くなります。ランタニドの寿命は 0.5 ～ 3 ms ですが、遷移金属配位子錯体の寿命は 10 ns ～ 10 μs です。蛍光寿命は、光破壊寿命や染料の「保存期間」と混同しないように注意してください。

多光子励起は、通常は 1 つの光子を個々のエネルギーの 2 倍で吸収する蛍光部分によって 2 つの低エネルギー光子が同時に吸収される現象を利用して、顕微鏡の視野面を焦点合わせする方法です。たとえば、2 つの NIR 光子 (800 nm) で UV 染料 (400 nm) を励起します。

完全に動かない蛍光部分は、偏光で励起されると、同様に偏光した光を発します。ただし、分子が動いている場合は、入射光とは異なる方向に放射することで光の偏光を「スクランブル」する傾向があります。

一部の蛍光化学物質は、温度上昇にさらされると顕著な蛍光消光を示します。この効果は、ミトコンドリアの熱発生特性の測定と調査に使用されています。この測定では、ミトコンドリアを標的とする熱感受性蛍光体を細胞内に配置し、ミトコンドリア内膜マトリックス面の負電荷により（蛍光体がカチオン性であるため）、蛍光体はミトコンドリア内に自然に局在します。 ^[14]これらの蛍光体の温度は蛍光発光に反比例するため、蛍光出力を測定することで、活発に呼吸しているミトコンドリアの温度を推定できます。使用される蛍光体は、通常、サーモフィッシャーのMitoTrackerプローブなどのローダミン B ^[14]由来の親油性カチオンです。^[15]この技術は、ミトコンドリアが生理的に細胞の他の部分よりも10℃以上高い50℃近くで維持されているという一般的な科学的コンセンサスに大きく貢献しました。^[16]

蛍光と温度の逆相関は、運動エネルギーに応じて蛍光体の環境における原子衝突の数が変化することで説明できます。衝突は無放射崩壊と熱としての余分なエネルギーの損失を促進するため、衝突が増えたり、衝突が強くなったりすると無放射崩壊が促進され、蛍光の放出が減少します。^[17]

しかし、この温度測定技術には限界がある。これらの陽イオン性蛍光体は、細胞の種類に応じて、ミトコンドリア内膜マトリックス面の電荷に大きく影響される。例えば、感熱性蛍光体MTY（MitoTracker Yellow）は、ヒト一次線維芽細胞のミトコンドリアにオリゴマイシン（ATP合成酵素阻害剤）を添加すると、突然、蛍光が急激に低下する。これはミトコンドリア温度の急激な上昇を示唆しているが、実際には、オリゴマイシンによるミトコンドリア内膜の過分極によって説明され、正に帯電したMTY蛍光体の分解につながる。^[14]

• 組織、細胞、または細胞内構造の蛍光顕微鏡検査は、抗体を蛍光体で標識し、抗体がサンプル内で標的抗原を見つけられるようにすることで行われます。複数の抗体を異なる蛍光体で標識すると、1 つの画像内で複数の標的を視覚化できます。
• 連鎖終結法によるDNAの自動配列決定。4 つの異なる連鎖終結塩基にはそれぞれ固有の蛍光タグが付いています。ラベル付けされた DNA 分子が分離されると、蛍光ラベルが UV 光源によって励起され、放出された光の波長によって分子を終結させる塩基の ID が識別されます。

• DNA 検出:臭化エチジウム化合物は、溶液中で自由に構造が変化すると、ほとんど蛍光を発しません。臭化エチジウムの蛍光は DNA に結合すると大幅に増強されるため、この化合物はアガロースゲル電気泳動で DNA 断片の位置を視覚化するのに非常に役立ちます。臭化エチジウムは有毒である可能性があり、より安全な代替品としてSYBR Green染料が知られています。
• DNAマイクロアレイ。
• 免疫学: 抗体には蛍光化学基が結合しており、抗体が結合した部位 (顕微鏡標本など) は蛍光によって確認でき、定量化することもできます。
• FACS（蛍光活性化細胞選別）。
• マイクロスケール熱泳動(MST) は、蛍光を読み取り値として使用し、微視的温度勾配​​における生体分子の方向性のある動きを定量化します。
• 蛍光は、オングストロームレベルで距離を測定する蛍光共鳴エネルギー移動などの技術を使用して、DNA やタンパク質の構造と立体配座を研究するために使用されてきました。これは、複数の生体分子の複合体において特に重要です。
• 蛍光は、さまざまな興味のあるタンパク質の共局在を研究するために応用することができます。^[18]その後、CoLocalizer Proなどの専用ソフトウェアを使用して分析することができます。

また、多くの生体分子は固有の蛍光性を持っており、化学タグを付けなくても使用できる場合があります。分子が特定の環境にあるとこの固有の蛍光性が変化することがあり、そのため分子の分布や結合を測定できます。たとえば、ビリルビンは血清アルブミンの特定の部位に結合すると強い蛍光性を示します。鉄が不足している場合や鉛が存在する場合にヘモグロビンの代わりに発達中の赤血球で形成される亜鉛プロト ポルフィリンは明るい蛍光性があり、これらの問題の検出に使用できます。

生物医学、生物学、および関連科学における蛍光の用途は継続的に拡大しています。これらの分野の分析方法も増えており、多くの場合、FLIM、FLI、FLIP、CALI、FLIE 、 FRET、FRAP、FCS、PFRAP、smFRET、FIONA、FRIPS、SHREK、SHRIMP、TIRFなどの頭字語の形で命名されています。これらの技術のほとんどは蛍光顕微鏡に依存しており、通常は水銀ランプやキセノンランプ、LED、またはレーザーなどの高強度光源を使用して、観察中のサンプルの蛍光を励起します。次に、光学フィルターが励起光を放出された蛍光から分離し、目視または（CCD）カメラやその他の光検出器（例：光電子増倍管、分光器）で検出します。このような顕微鏡の機能、使用する蛍光プローブ、およびそれらが適用されるアプリケーションを改善するために、かなりの研究が進行中です。特に注目すべきは共焦点顕微鏡です。これはピンホールを使用して光学断面を作成し、サンプルの定量的な 3D ビューを提供します。

• 蛍光体
• 蛍光顕微鏡
• 蛍光イメージング
• 蛍光グルコースバイオセンサー
• 透視検査