シアニン

シアニン色素は、テトラメチルインド（ジ）カルボシアニン色素^{[ 1 ]}とも呼ばれ、ポリメチン色素群に属する合成色素ファミリーです。その名前は語源的には青の色合いを表す言葉に由来しますが、シアニン色素ファミリーは近赤外線から紫外線までの電磁スペクトルをカバーしています。

化学的には、シアニンは2つの窒素原子間の共役系であり、各共鳴構造において、ちょうど1つの窒素原子がイミニウムに酸化されている。通常、それらは窒素含有複素環系の一部を形成する。^{[ 2 ]}

シアニン色素の主な用途は生物学的標識である。しかしながら、その合成法と用途に関する文献は豊富にあり、シアニン色素は一部のCDやDVDメディアにも広く用いられている。

シアニン色素はさまざまな方法で分類されてきました: ^{[ 3 ]}

• ストレプトシアニンまたはオープンチェーンシアニン：

R ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (I)

• ヘミシアニン色素：

アリール=N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (II)

• 閉鎖シアニン：

アリール=N ⁺ =CH[CH=CH] _n -N=アリール(III)

さらに、以下のクラスが認識されています: ^{[ 4 ]}

• ニュートロシアニン：

R ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -CNおよびR ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -CHO

• スピロピラン類やキノフタロン類を含むメロシアニン類。
• アポシアニン

2 つの第 4 級窒素がポリメチン鎖で結合している。^{[ 5 ]}両方の窒素はそれぞれ独立して、ピロール、イミダゾール、チアゾール、ピリジン、キノリン、インドール、ベンゾチアゾールなどのヘテロ芳香族部分の一部になり得る。さらに、シアニンのポリメチン鎖はさまざまな置換基を持つことができ、スペクトル特性の変調を可能にし、追加の機能をもたらすことができる。 ^{[ 6 ]}この特徴は合理的に予測できる。^{[ 7 ]}

長鎖シアニン色素は比較的不安定な構造を持つ。ヘプタメチンシアニン色素は自発的に熱分解してペンタメチンシアニンになり、ペンタメチンシアニンはアミン塩基の存在下でトリメチンシアニンと同様の分解を起こす可能性がある。^{[ 8 ] [ 9 ]}

シアニン色素は、1世紀以上前に石炭タールから蒸留した原料を用いて初めて合成されました。主な成分はキノリンとレピジン（4-メチルキノリン）でした。^{[ 4 ]}

これらは元々、そして現在も、写真乳剤の感度範囲を広げるために使用されており、つまり、フィルム上に画像を形成する波長の範囲を広げ、フィルムをパンクロマチックにするために使用されます。^{[ 4 ]}シアニンは、CD-RおよびDVD-Rメディアにも使用されています。使用されているもののほとんどは緑色または水色で、化学的に不安定です。そのため、安定化されていないシアニン ディスクは、アーカイブ CD および DVD の使用には適していません。最近のシアニン ディスクには、シアニン分子に結合した金属原子などの安定剤が含まれており、^{[ 10 ]}劣化を大幅に遅らせます。これらのディスクは、75 年以上のアーカイブ寿命と評価されることがよくあります。CD-R で使用される他の染料は、フタロシアニンとアゾです。

シアニン色素は、より明るく安定した蛍光を発するため、フルオレセインやローダミンなどの従来の色素に代わる有利な選択肢となり得る。

• Cy3とCy5は最も人気があり、通常は2色検出のために組み合わせて使用​​されます。

Cy3は緑黄色（励起約550 nm、発光約570  nm）に蛍光を発する一方、Cy5は遠赤色領域（励起約650 nm、 発光約670 nm）に蛍光を発する。^{[ 17 ]} Cy3は、テトラメチルローダミン（TRITC）用の標準フィルターを備えた様々な蛍光光度計、イメージャー、顕微鏡で検出できる。モル吸光係数が高いため、この色素は電気泳動ゲル上や溶液中でも肉眼で容易に検出できる。Cy5は、高い吸光係数（ゲル電気泳動では1ナノモルという少量でも肉眼で検出可能）と、多くのCCD検出器が最大感度を持ち、生物学的対象物によるバックグラウンド干渉が少ない赤色領域に蛍光色素の発光最大値があることから、遠赤色蛍光色素の代替として広く用いられるようになった。

これらのスキャナーは、実際には多様なレーザー発光波長（一般的には532 nmと635 nm）とフィルター波長（550～600 nmと655～695 nm）を使用して、バックグラウンド汚染を回避しています。そのため、Cy3とCy5の色を容易に区別できるだけでなく、1つのサンプル中のCy3とCy5の標識量を定量化することも可能です（多項目検出）。

• 他のシアニン色素も有用である。

Cy3.5はスルホローダミン101の代替として使用できる。

Cy5.5は近赤外線（IR）蛍光発光色素である（励起/発光最大波長は678/694  nm）。

Cy7は肉眼では見えない近赤外蛍光色素です（励起/発光最大波長は750/776 nm）。Cy7.5色素と同様に、生体内 イメージング用途に用いられます。

スルホシアニン色素は1つまたは2つのスルホ基を持ち、Cy色素を水溶性にするが、さらに高い水溶性を得るためにトリスルホン化およびクアドリスルホン化形態も利用可能である。^{[ 13 ]} PEG化は、色素だけでなく標識された複合体にも親水性を与えるもう1つの修飾である。

アプリケーション

シアニン色素は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸プローブ、およびその他あらゆる種類の生体分子を標識するために使用され、フローサイトメトリー、顕微鏡検査（主に可視光領域、UVおよびIRも）、マイクロプレートアッセイ、マイクロアレイ、および「ライトアッププローブ」、生体内イメージングなど、さまざまな蛍光検出技術に使用されます。^{[ 23 ]}

核酸標識

マイクロアレイ実験では、 DNAまたはRNAは、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（NHSエステル）反応性基を持つように合成されたCy3またはCy5で標識されます。NHSエステルは脂肪族アミン基とのみ容易に反応しますが、核酸にはアミン基がないため、ヌクレオチドをアミノアリル基で修飾する必要があります。これは、合成反応中にアミノアリル修飾ヌクレオチドを組み込むことによって行われます。標識が互いに近すぎると消光効果が生じるため、60塩基ごとに標識するのが適切な比率です。

タンパク質標識

タンパク質標識の場合、Cy3およびCy5色素は、アミンと反応するためのスクシンイミジル基、またはシステイン残基のスルフィドリル基と反応するためのマレイミド基を持つことがある。

Cy5は電子環境に敏感である。結合したタンパク質の立体構造の変化によって、発光の増強または消光が生じる。この変化の速度を測定することで、酵素反応速度パラメータを決定できる。これらの色素は、FRET実験においても同様の目的で使用できる。

Cy3とCy5はプロテオミクス実験で使用され、2つのソースからのサンプルを混合して分離プロセスで一緒に実行できるようにします。^{[ 24 ] [ 25 ]}これにより、サンプルを別々に実行した場合に避けられない、異なる実験条件による変動が排除されます。これらの変動により、分離完了後にコンピュータを使用してデータの取得を自動化することは、不可能ではないにしても非常に困難になります。これらの色素を使用すると、自動化は簡単になります。

シアニンという言葉は、英語の「cyan」に由来し、慣習的に青緑色（「アクア」に近い）を意味しますが、ギリシャ語のκυάνεος / κυανοῦς kyaneos/kyanousに由来し、これは少し異なる色、「濃い青」を意味します。