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ファロイジンは、テングタケ属のキノコに含まれるファロトキシンと呼ばれる毒素の一種です。これは、血流に注入されると数日で致死性を示す、剛直な二環式ヘプタペプチドです。ファロイジン中毒の主な症状は、肝細胞の破壊による急性の飢餓です。ファロイジンは、線維状アクチン（F-アクチン）に結合して安定化させることで機能し、アクチン線維の脱重合を効果的に防ぎます。F-アクチンへの強固かつ選択的な結合のため、蛍光タグを含むファロイジン誘導体は、生物医学研究においてF-アクチンを可視化するために顕微鏡検査で広く使用されています。
ファロイジンは最初に発見された環状ペプチドの1つです。 1937年にフェオドール・リネンとウルリッヒ・ヴィーラント[ 1 ]によってタマゴテングタケから単離され、結晶化されました[ 2 ]。その構造は、システイン-トリプトファン結合によって二環式ヘプタペプチドを形成するという点で特異です。この結合はそれまで特徴づけられておらず、ファロイジンの構造解明を著しく困難にしています。彼らはUV分光法を用いて硫黄原子の存在を決定し、この環状構造の波長がわずかにシフトしていることを発見しました。ラネーニッケル実験により、トリプトファン環に硫黄が存在することが確認されました。研究者らは、脱硫したファロイジンが依然として環状であることを発見し、ファロイジンの構造が通常は二環式であることを示しました。線状化された後、脱硫したファロイジンのアミノ酸配列は、1955年にヴィーラントとシェーンによってエドマン分解によって解明されました[ 3 ]。
アクチンに対する高い親和性から、科学者たちは顕微鏡下でのアクチンの効果的な可視化のための染色試薬としてのその潜在的な用途を発見した。蛍光色素と結合した誘導体は広く販売されている。蛍光標識ファロイジンは、線維状アクチン（F-アクチン）に選択的に結合し、アクチンモノマー（G-アクチン）には結合しないため、アクチンに対する抗体よりも効果的である。[ 4 ]
ファロイジンは、珍しいシステイン-トリプトファン結合を含む二環式ヘプタペプチドである。ファロイジンの合成をコードする遺伝子は、タマゴテングタケのMSDINファミリーに属し、34アミノ酸からなるプロペプチドをコードする。プロリン残基は、後にファロイジンとなる7残基領域を挟んでいる。翻訳後、ペプチドはタンパク質分解によって切断され、環化され、水酸化され、トリプトファン-システインが架橋されてトリプタチオニンが形成され、エピマー化されてD-トレオニンが形成される必要がある。これらのステップの順序と正確な生化学的メカニズムはまだ完全には解明されていない。現在のところ、必要な生合成遺伝子はMSDIN遺伝子の近くにクラスター化していると考えられている。[ 5 ]
34量体の最初の翻訳後修飾は、プロリルオリゴペプチダーゼ（POP）によるタンパク質分解切断で、10アミノ酸の「リーダー」ペプチドが除去される。次に、POPはアミノ酸1（Ala）とアミノ酸7（Pro）の間でトランスペプチド化を行い、ヘプタペプチドAla-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Proを環状化する。次に、Trp-Cys架橋によるトリプタチオニンの形成が起こり、これは別の酵素によって行われると考えられている。[ 5 ]
ファロイジンはアクチンポリマーに結合して安定化させる能力があるため利用されていますが、細胞は容易にファロイジンを取り込むことができないため、科学者たちは研究においてファロイジン誘導体の方がより有用であることを発見しました。基本的には、ヒドロキシプロリンを用いた典型的な小ペプチド合成法に従います。合成における主な難点は、トリプタチオニン結合（システイン-トリプトファン架橋）の形成です。
以下は、2005 年に Anderson らが行った、ala 7 -ファロイジンの固相合成の一般的な合成メカニズムです。これは、以下に示すように、ファロイジンとは 7 番目の残基が異なります。[ 6 ] THPP はテトラヒドロピラニルポリスチレンリンカーの略で、合成中に分子を固体支持体に連結するために使用されます。以下の合成は、出発物質を連結するための結合形成の順序を示す一般的なスキームであることに注意してください。ala 7 -ファロイジンおよびファロイジンの他の多くの類似の変異体は、ファロイジンと比較して細胞への取り込みを増加させ、顕微鏡での F-アクチンの可視化を助けるために蛍光色素を付加するのに役立ちます。
ファロイジンの最初の全合成は、固相合成と溶液相合成を組み合わせることによって達成された（Baosheng LiuおよびJianheng Zhang、米国特許US 8,569,452 B2）。合成されたファロイジンの物理的および化学的性質は、天然に存在するファロイジンと同じである。
ファロイジンはF-アクチンに結合し、その脱重合を防ぎ、細胞を毒します。ファロイジンはF-アクチンサブユニット間の界面に特異的に結合し、隣接するサブユニットを一緒に固定します。二環式ヘプタペプチドであるファロイジンは、アクチンモノマーよりもアクチンフィラメントに強く結合し、フィラメント末端からのアクチンサブユニットの解離の速度定数を低下させ、フィラメントの脱重合を防ぐことでアクチンフィラメントを安定化させます。[ 7 ]さらに、ファロイジンはF-アクチンのATP加水分解活性を阻害することがわかっています。[ 8 ]このように、ファロイジンはG-アクチンとは異なるコンフォメーションでアクチンモノマーを捕捉し、ADPの捕捉に関連するモノマー解離の速度定数を大幅に低下させることでF-アクチンの構造を安定化させます。[ 8 ]総じて、ファロイジンはアクチンと化学量論的に反応し、アクチン重合を強く促進し、アクチンポリマーを安定化することがわかっている。[ 9 ]
ファロイジンは細胞内で濃度によって異なる働きをする。低濃度で細胞質に導入されると、ファロイジンは細胞質アクチンの重合度の低い形態とフィラミンを凝集したアクチンポリマーの安定した「島」に集めるが、ストレスファイバー、すなわち太いマイクロフィラメントの束には干渉しない。[ 9 ]ウェーランドらは、高濃度ではファロイジンが細胞収縮を誘発することも指摘している。[ 9 ]
発見後まもなく、科学者たちはファロイジンをマウスに注射し、腹腔内注射によるLD50が2mg /kgであることを発見した。最小致死量に曝露された場合、これらのマウスが死亡するまでには数日かかった。ファロイジン中毒の唯一の明らかな副作用は極度の空腹感である。 これは、ファロイジンが胆汁酸膜輸送タンパク質を介してのみ肝臓に取り込まれるためである。[ 10 ]肝臓内に入ると、ファロイジンはFアクチンに結合し、その脱重合を阻害する。このプロセスが肝細胞を破壊するには時間がかかる。腎臓もファロイジンを取り込むことができるが、肝臓ほど効果的ではない。ここでは、ファロイジンはネフローゼを引き起こす。[ 11 ]
ファロイジンの特性により、ファロイジンを蛍光アナログで標識し、それを用いてアクチンフィラメントを染色して光学顕微鏡で観察することで、細胞内のFアクチンの分布を調べるのに便利なツールとなっています。ファロイジンの蛍光誘導体は、生細胞または固定細胞内のアクチンフィラメントの位置特定や、試験管内での個々のアクチンフィラメントの可視化に非常に有用であることが判明しています。[ 7 ]蛍光タグとして機能する蛍光色素エオシンに結合したファロイジンを使用することで、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルでFアクチンを検出する高解像度技術が開発されました。[ 12 ]蛍光光酸化として知られるこの方法では、蛍光分子を使用してジアミノベンジジン（DAB）の酸化を促進し、電子密度が高く電子顕微鏡で検出可能な反応生成物を作成できます。[ 12 ]蛍光ファロイジンを飽和量使用すれば、可視化された蛍光量を細胞内の線維状アクチンの量の定量的尺度として使用できる。[ 7 ]その結果、ファロイジンのマイクロインジェクションと免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせることで、細胞質アクチンのポリマー形成のさまざまな段階における直接的および間接的な機能を評価できる。[ 9 ]したがって、蛍光ファロイジンは、高解像度でアクチンネットワークを研究するための重要なツールとして使用できる。
ファロイジンは、蛍光顕微鏡観察のために細胞タンパク質を標識する際に一般的に使用される抗体よりもはるかに小さいため、線維状アクチンをより高密度に標識することができ、特に高解像度において、より詳細な画像を取得することが可能となる。
未修飾のファロイジンは細胞膜を透過しないため、生細胞を用いた実験では効果が低い。細胞透過性を大幅に向上させたファロイジン誘導体が合成されている。
ファロイジンで処理された細胞は多くの毒性効果を示し、しばしば死滅する。[ 7 ]さらに、ファロイジンで処理された細胞は細胞膜に付着するアクチンのレベルが高くなり、生細胞へのファロイジンのマイクロインジェクションはアクチン分布と細胞運動性を変化させる。[ 7 ]