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生化学において、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）は、様々なタンパク質と結合する酸化還元活性補酵素であり、代謝におけるいくつかの酵素反応に関与している。フラボタンパク質とは、FADまたはフラビンモノヌクレオチド（FMN）の形でフラビン基を含むタンパク質である。多くのフラボタンパク質が知られており、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成要素、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成要素などが挙げられる。
FAD は、完全に酸化された形態 (FAD) と完全に還元された二水素化形態 FADH 2という 2 つの一般的な酸化状態をとります。N-オキシド状態やセミキノン状態など、他の酸化状態も存在します。[ 1 ]完全に酸化された形態の FAD は、2 つの電子と 2 つのプロトンを受け取って FADH 2になります。セミキノン (FADH · ) は、FAD の還元、または FADH 2の酸化のいずれかによって、それぞれ 1 つの電子と 1 つのプロトンを受け取るか、または供与することによって形成されます。ただし、一部のタンパク質は、フラビン補因子の超酸化形態であるフラビン-N(5)-オキシドを生成および維持します。[ 2 ] [ 3 ]
フラボタンパク質は、1879 年に牛乳の成分を分離することによって初めて発見されました。当初は、乳由来で黄色色素であることからラクトクロムと呼ばれていました。[ 4 ]科学界が黄色色素の原因となる分子を特定するのに実質的な進歩を遂げるまでには 50 年かかりました。1930 年代には、多くのフラビンおよびニコチンアミド誘導体構造とその酸化還元触媒における必須の役割が発表され、補酵素研究の分野が始まりました。ドイツの科学者オットー・ワールブルクとヴァルター・クリスティアンは、1932 年に細胞呼吸に必要な酵母由来の黄色タンパク質を発見しました。彼らの同僚であるヒューゴ・テオレルはこの黄色酵素をアポ酵素と黄色色素に分離し、酵素も色素も単独ではNADH を酸化する能力はないが、それらを混ぜ合わせると活性が回復することを示しました。テオレルは1937年に、その色素がリボフラビンのリン酸エステルであるフラビンモノヌクレオチド（FMN）であることを確認し、これが酵素補因子の最初の直接的な証拠となった。[ 5 ]ワールブルクとクリスチャンは、 1938年に同様の実験を通してFADがD-アミノ酸オキシダーゼの補因子であることを発見した。[ 6 ]ワールブルクによるニコチンアミドとヒドリド転移の関連付けとフラビンの発見は、40年代と50年代の多くの科学者が大量の酸化還元生化学を発見し、クエン酸回路やATP合成などの経路でそれらを関連付ける道を開いた。
フラビンアデニンジヌクレオチドは、アデニンヌクレオチド（アデノシン一リン酸）とフラビンモノヌクレオチド（FMN）の2つの部分から構成され、リン酸基を介して結合しています。アデニンは環状リボースの1'炭素に結合し、リン酸はリボースの5'炭素に結合してアデニンヌクレオチドを形成します。リボフラビンは、イソアロキサジンとリビトールの間の炭素-窒素（CN）結合によって形成されます。次に、リン酸基が末端リボース炭素に結合してFMNを形成します。イソアロキサジンとリビトールの間の結合はグリコシド結合とはみなされないため、フラビンモノヌクレオチドは厳密にはヌクレオチドではありません。[ 7 ]このため、ジヌクレオチドという名称は誤解を招きますが、フラビンモノヌクレオチドグループは構造と化学的性質においてヌクレオチドに非常に近いものです。
FAD は2 H +と 2 e −の付加によりFADH 2に還元される。FADH 2 は1 H +と 1 e −の喪失により酸化されて FADH を形成する。FAD 型は、さらに 1 H +と 1 e −の喪失により再生される。FAD の生成は、フラビン-N(5)-オキシドの還元と脱水によっても起こる。[ 8 ]フラビンは、酸化状態に基づいて、水溶液中で特定の色をとる。フラビン-N(5)-オキシド(超酸化) は黄橙色、FAD (完全酸化) は黄色、FADH (半還元) はpHに応じて青色または赤色、完全還元型は無色である。[ 9 ] [ 10 ]形態の変化は、他の化学的性質に大きな影響を与える可能性がある。例えば、FAD は完全に酸化された形態であり、求核攻撃を受けやすく、完全に還元された形態である FADH 2は高い分極率を持ち、半還元された形態は水溶液中で不安定です。[ 11 ] FAD は芳香環系ですが、FADH 2 はそうではありません。[ 12 ]これは、FADH 2は芳香族構造によってもたらされる共鳴による安定化なしに、エネルギーが著しく高いことを意味します。FADH 2は、酸化されると芳香族性を回復し、この安定化によって表されるエネルギーを放出するため、エネルギーを運ぶ分子です。
FADとその変異体の分光学的特性により、UV-VIS吸収分光法および蛍光分光法を用いて反応をモニタリングできます。FADの各形態はそれぞれ異なる吸収スペクトルを持ち、酸化状態の変化を容易に観察できます。 [ 11 ] FADの主要な局所吸収極大は450 nmで観察され 、消光係数は11,300 M −1 cm −1です。[ 13 ]フラビンは一般的に非結合時に蛍光活性を持ちます（フラビン核酸誘導体に結合したタンパク質はフラボタンパク質と呼ばれます）。この特性は、タンパク質結合を調べる際に利用でき、結合状態になると蛍光活性が失われることを観察できます。[ 11 ]酸化フラビンは約450 nmで高い吸収を示し、約515～520 nmで蛍光を発します。[ 9 ]
生体システムにおいて、FADは完全に酸化された状態ではH +とe−の受容体として働き、FADH2の状態ではその受容体または供与体として働き、還元されたFADH2の状態ではその供与体として働く。下の図は、FADが起こりうる変化をまとめたものである。
上記以外にも、FADは様々な反応性形態を生成・消費します。これらの反応には電子の移動や化学結合の形成・切断が伴います。FADは反応機構を通して、生体システム内の化学活動に貢献します。以下の図は、FADが関与する可能性のあるいくつかの反応の一般的な形態を示しています。
機構1と2はヒドリド獲得を表し、分子は実質的に1つのヒドリドイオンを獲得します。機構3と4はラジカル生成とヒドリド脱離を表します。ラジカル種は不対電子原子を含み、非常に化学的に活性です。ヒドリド脱離は、先に述べたヒドリド獲得の逆の過程です。最後の2つの機構は、求核付加と炭素ラジカルを用いた反応を示しています。
FADは、リボフラビン由来の別の分子であるフラビンモノヌクレオチドとともに、酵素補因子として重要な役割を果たします。 [ 8 ]細菌、真菌、植物はリボフラビンを生成できますが、ヒトなどの他の真核生物はそれを生成する能力を失っています。[ 9 ]そのため、ヒトはビタミンB2としても知られるリボフラビンを食事から摂取する必要があります。[ 14 ]リボフラビンは通常、小腸で摂取され、キャリアタンパク質を介して細胞に輸送されます。[ 9 ]リボフラビンキナーゼ（EC 2.7.1.26）はリボフラビンにリン酸基を付加してフラビンモノヌクレオチドを生成し、次にFADシンテターゼがアデニンヌクレオチドを付加します。どちらのステップもATPを必要とします。[ 9 ]細菌は通常、1つの二機能性酵素を持っていますが、古細菌と真核生物は通常2つの異なる酵素を使用します。[ 9 ]現在の研究では、細胞質とミトコンドリアに異なるアイソフォームが存在することが示されています。[ 9 ] FADは両方の場所で合成され、必要に応じて輸送される可能性があるようです。[ 11 ]
フラボタンパク質は、フラビン部分のユニークで多用途な構造を利用して、困難な酸化還元反応を触媒します。フラビンは複数の酸化還元状態を持つため、1つまたは2つの電子、水素原子、またはヒドロニウムイオンの移動を伴うプロセスに参加できます。完全に酸化されたフラビン環のN5とC4aも求核攻撃を受けやすいです。[ 15 ] フラビン部分のイオン化と修飾のこの幅広い多様性は、イソアロキサジン環系と、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を含むフラビンの結合時にフラビンの速度論的パラメーターを劇的に変化させるフラボタンパク質の能力に起因すると考えられます。
ゲノム中のフラビン依存性タンパク質をコードする遺伝子の数（フラボプロテオーム）は種によって異なり、0.1%～3.5%の範囲であり、ヒトは90個のフラボタンパク質をコードする遺伝子を持っています。[ 16 ] FADはフラビンのより複雑で豊富な形態であり、全フラボプロテオームの75% [ 16 ]およびヒトがコードするフラボタンパク質の84%に結合すると報告されています。[ 17 ] さまざまな培養哺乳類細胞株における遊離または非共有結合フラビンの細胞内濃度は、FAD（2.2～17.0 amol/細胞）およびFMN（0.46～3.4 amol/細胞）について報告されています。[ 18 ]
FAD はNAD+よりも正の還元電位を持ち、非常に強力な酸化剤です。細胞は、CC 結合のアルケンへの脱水素化など、エネルギー的に困難な多くの酸化反応でこれを利用します。FAD 依存性タンパク質は、電子伝達、DNA 修復、ヌクレオチド生合成、脂肪酸のβ 酸化、アミノ酸異化、およびCoA、CoQ、ヘム基などの他の補因子の合成を含む、非常に多様な代謝経路で機能します。よく知られている反応の 1 つは、クエン酸回路(TCA またはクレブス回路としても知られています)の一部です。コハク酸デヒドロゲナーゼ(電子伝達鎖の複合体 II ) は、共有結合した FAD を必要とし、ユビキノンのユビキノールへの還元と共役させてコハク酸をフマル酸に酸化する反応を触媒します。[ 11 ]この酸化から得られた高エネルギー電子は、FAD を FADH 2に還元することによって一時的に貯蔵されます。 FADH 2はその後 FAD に戻り、その 2 つの高エネルギー電子を電子伝達系に送ります。FADH 2のエネルギーは、酸化的リン酸化によって1.5 等価のATP [ 19 ]を生成するのに十分です。一部のレドックスフラボタンパク質は、脂肪酸のβ 酸化や、ロイシン(イソバレリル-CoA デヒドロゲナーゼ)、イソロイシン(短鎖/分岐鎖アシル-CoA デヒドロゲナーゼ)、バリン (イソブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ)、リジン(グルタリル-CoA デヒドロゲナーゼ) などのアミノ酸の異化に関与するアセチル-CoA デヒドロゲナーゼのように、 FADに非共有結合します。[ 20 ] 代謝を調節するFAD依存性酵素のその他の例としては、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（トリグリセリド合成）とプリンヌクレオチド異化に関与するキサンチンオキシダーゼが挙げられる。[ 21 ]フラボタンパク質においてFADが担う非触媒機能には、構造的役割、生物時計や発生を調節する 青色光感受性光受容体への関与、生物発光細菌における光の生成などがある。[ 20 ]
フラボタンパク質は補欠分子族としてFMNまたはFAD分子のいずれかを持ち、この補欠分子族は強固に結合しているか共有結合している。フラボタンパク質の約5～10%のみが共有結合したFADを持つが、これらの酵素はより強い酸化還元力を持つ。 [ 11 ]場合によっては、FADは活性部位の構造的サポートを提供したり、触媒作用中の中間体の安定化を提供したりすることができる。[ 20 ]利用可能な構造データに基づいて、既知のFAD結合部位は200種類以上に分類できる。[ 22 ]
ヒトゲノムには90種類のフラボタンパク質がコードされており、約84%がFADを必要とし、約16%がFMNを必要とする一方、5種類のタンパク質は両方の存在を必要とする。[ 17 ]フラボタンパク質は、その酸化還元力のため、主にミトコンドリアに存在する。 [ 17 ]すべてのフラボタンパク質のうち、90%が酸化還元反応を行い、残りの10%は転移酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼである。[ 16 ]
モノアミン酸化酵素（MAO）は、ノルエピネフリン、セロトニン、ドーパミンの異化における生物学的重要性から、広く研究されているフラボ酵素です。MAOは、第一級、第二級、第三級アミンを酸化し、非酵素的にイミンからアルデヒドまたはケトンに加水分解します。このクラスの酵素は広く研究されていますが、その作用機序については依然として議論が続いています。ラジカル機構と求核機構の2つの機構が提案されています。ラジカル機構は、ラジカル中間体の存在を示すスペクトルまたは電子常磁性共鳴の証拠がないため、あまり一般的に受け入れられていません。求核機構は、基質の求核性を高めると予想される2つのチロシン残基を変異させた部位特異的変異誘発研究によって支持されているため、より有力視されています。 [ 23 ]
グルコースオキシダーゼ（GOX）は、β-D-グルコースをD-グルコノ-δ-ラクトンに酸化すると同時に、酵素に結合したフラビンを還元する反応を触媒します。GOXはホモ二量体として存在し、各サブユニットは1分子のFADを結合します。結晶構造は、FADが二量体界面近くの酵素の深いポケットに結合することを示しています。研究によると、FADを8-ヒドロキシ-5-カルバ-5-デアザFADに置き換えると、フラビンのre面と反応することで反応の立体化学が決定されます。ターンオーバー中に中性および陰イオン性のセミキノンが観察され、ラジカル機構を示しています。[ 23 ]
プレニルシステインリアーゼ（PCLase）は、プレニルシステイン（タンパク質修飾）の切断を触媒し、イソプレノイドアルデヒドとタンパク質標的上の遊離システイン残基を形成します。FADはPCLaseに非共有結合しています。フラビンの反応を調べた機構研究はあまり行われていませんが、提案されている機構を以下に示します。プレニル部分のC1からFADへのヒドリド転移が提案されており、その結果、フラビンがFADH 2に還元されます。COformEDは、隣接する硫黄原子によって安定化されたカルボカチオンです。FADH 2は分子状酸素と反応して酸化された酵素を再生します。[ 23 ]
UDP-N-アセチルエノールピルビルグルコサミン還元酵素（MurB）は、NADPH依存的にエノールピルビル-UDP-N-アセチルグルコサミン（基質）を対応するD-ラクチル化合物UDP-N-アセチルムラミン酸（生成物）に還元する反応を触媒する酵素です。MurBは単量体であり、1分子のFADを含んでいます。基質が生成物に変換される前に、まずNADPHがFADを還元する必要があります。NADP +が解離すると、基質が結合し、還元されたフラビンが生成物を還元することができます。[ 23 ]
グルタチオン還元酵素（GR）は、グルタチオンジスルフィド（GSSG）をグルタチオン（GSH）に還元する反応を触媒します。GRはこの反応を促進するためにFADとNADPHを必要とします。まず、ヒドリドがNADPHからFADに転移する必要があります。還元されたフラビンは求核剤として作用してジスルフィドを攻撃し、C4a-システイン付加体を形成します。この付加体の除去により、フラビン-チオラート電荷移動複合体が生成されます。[ 23 ]
モノオキシゲナーゼ（水酸化）反応を触媒するシトクロムP450型酵素は、FADからP450への2つの電子の伝達に依存している。真核生物には2種類のP450システムが存在する。小胞体に存在するP450システムは、FADとFMNの両方を含むシトクロムP-450還元酵素（CPR）に依存している。還元型FAD（ FADH2 ）上の2つの電子は1つずつFMNに伝達され、その後、1つの電子がFMNからP450のヘムに渡される。[ 24 ]
ミトコンドリアに存在するP450システムは、2つの電子伝達タンパク質に依存しています。1つはFADを含むアドレノドキシン還元酵素（AR）、もう1つは鉄硫黄基を含む小さなタンパク質であるアドレノドキシンです。FADはARのFAD結合ドメインに埋め込まれています。[ 25 ] [ 26 ] ARのFADは、ARのNADP結合ドメインに結合するNADPHから2つの電子が伝達されることでFADH2に還元されます。この酵素の構造は、効率的な電子伝達のために電子供与体NADPHと受容体FADの正確な配置を維持するために高度に保存されています。[ 26 ]還元されたFADの2つの電子は、1つずつアドレノドキシンに伝達され、アドレノドキシンは、その1つの電子をミトコンドリアP450のヘム基に供与します。[ 27 ]
ミクロソームP450系の還元酵素とミトコンドリアP450系の還元酵素の構造は完全に異なり、相同性は見られない。[ 24 ]
p-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（PHBH）は、p-ヒドロキシ安息香酸（pOHB）を3,4-ジヒドロキシ安息香酸（3,4-diOHB）に酸化する反応を触媒します。この反応には、FAD、NADPH、および分子状酸素がすべて必要です。NADPHはまずヒドリド等価物をFADに転移させてFADH−を生成し、次にNADP +が酵素から解離します。還元されたPHBHは分子状酸素と反応してフラビン-C(4a)-ヒドロペルオキシドを形成します。フラビンヒドロペルオキシドはpOHBを速やかに水酸化し、その後水を脱離して酸化フラビンを再生します。[ 23 ]フラビンを介した別の酸化機構では、フラビン-C(4a)-(ヒドロ)ペルオキシドではなくフラビン-N(5)-オキシドが使用されます。 [ 2 ] [ 3 ]
コリスミ酸シンターゼ（CS）は、シキミ酸経路の最終段階であるコリスミ酸の生成を触媒します。CSには2つのクラスが知られており、どちらもFMNを必要としますが、還元剤としてNADPHを必要とするかどうかで区別されます。CSの提案されているメカニズムにはラジカル種が関与しています。ラジカルフラビン種は、基質アナログを使用しない限り分光学的に検出されておらず、これはその寿命が短いことを示唆しています。しかし、フッ素化基質を使用すると、中性フラビンセミキノンが検出されました。[ 23 ]
グルタミン酸シンターゼは、L-グルタミンを反応の窒素源として、2-オキソグルタル酸をL-グルタミン酸に変換する反応を触媒します。すべてのグルタミン酸合成酵素は、鉄硫黄クラスターとFMNを含む鉄硫黄フラボタンパク質です。グルタミン酸合成酵素は、配列と生化学的特性に基づいて3つのクラスに分類されます。この酵素には3つのクラスがありますが、FMNを最初に還元する物質が異なるだけで、すべて同じメカニズムで機能すると考えられています。この酵素は2つのグルタミン酸分子を生成します。1つはグルタミンの加水分解（グルタミン酸とアンモニアを生成）によるもので、もう1つは最初の反応で生成されたアンモニアが2-オキソグルタル酸を攻撃し、FMNによってグルタミン酸に還元されるものです。[ 23 ]
フラボタンパク質の重要性を考えると、ヒトのフラボタンパク質の約60%が変異するとヒトの疾患を引き起こすことは驚くべきことではありません。[ 17 ] 場合によっては、これはFADまたはFMNへの親和性の低下によるものであり、そのため、リボフラビンの過剰摂取は、多発性アシルCoA脱水素酵素欠損症などの疾患症状を軽減する可能性があります。[ 9 ] さらに、リボフラビン欠乏症自体（およびそれに伴うFADとFMNの不足）は健康上の問題を引き起こす可能性があります。[ 9 ]例えば、ALS患者では、FAD合成レベルが低下しています。[ 9 ] これらの経路はいずれも、発達異常や消化器異常、脂肪分解異常、貧血、神経学的問題、癌や心臓病、片頭痛、視力低下、皮膚病変など、さまざまな症状を引き起こす可能性があります。[ 9 ] そのため、製薬業界は、特定のケースで食事を補うためにリボフラビンを製造しています。 2008年、リボフラビンの世界的需要は年間6,000トンで、生産能力は10,000トンでした。[ 4 ]この1億5,000万ドルから5億ドルの市場は、医療用途だけでなく、農業における動物飼料のサプリメントや食品着色料としても使用されています。[ 4 ]
一般的な抗生物質に対する細菌の抗生物質耐性が増加するにつれて、抗菌薬の新しい設計は科学研究において引き続き重要になっています。FAD（複合体II）を使用する特定の代謝タンパク質は細菌の病原性に不可欠であるため、FAD合成を標的にしたり、FAD類似体を作成したりすることは有用な研究分野となる可能性があります。[ 28 ]科学者はすでに、FADが結合すると通常取る2つの構造、つまり、分子が基本的に半分に折り畳まれ、アデニン環とイソアロキサジン環が積み重なる伸長型または蝶型コンフォメーションのいずれかを決定しました。[ 14 ] 同様の方法で結合できるがタンパク質機能を許さないFAD模倣体は、細菌感染を阻害する有用なメカニズムとなる可能性があります。[ 14 ] あるいは、FAD合成を阻害する薬で同じ目標を達成できる可能性があります。これは特に興味深い。なぜなら、ヒトと細菌のFAD合成は非常に異なる酵素に依存しているため、細菌のFAD合成酵素を標的とする薬剤はヒトのFAD合成酵素に干渉する可能性は低いからである。[ 29 ]
オプトジェネティクスは、非侵襲的な方法で生物学的イベントを制御することを可能にする。[ 30 ] この分野は近年、青色光利用FADドメイン（BLUF）などの光感受性を誘発するツールを含む多くの新しいツールによって進歩している。BLUFは、植物や細菌の光受容体から派生した100～140アミノ酸配列をコードしている。 [ 30 ]他の光受容体 と同様に、光はBLUFドメインに構造変化を引き起こし、下流の相互作用の阻害につながる。[ 30 ]現在の研究では、付加されたBLUFドメインを持つタンパク質と、さまざまな外部要因がタンパク質にどのように影響するかを調査している。[ 30 ]
体内には、トリプトファン、コラーゲン、FAD、NADH 、ポルフィリンなど、固有の蛍光を発する分子が数多く存在します。[ 31 ] 科学者たちは、これらの分子を利用して、病気の進行や治療効果のモニタリング、診断の補助を行ってきました。例えば、FADとNADHの固有蛍光は、正常組織と口腔粘膜下線維症で異なり、口腔粘膜下線維症は浸潤性口腔癌の初期兆候です。[ 31 ]そのため、医師たちは、従来の生検 に代えて、診断や治療のモニタリングに蛍光を利用してきました。[ 31 ]
