分子診断

分子生物学アッセイツールの工業化により、臨床現場での使用が実用的になった。^{[ 2 ]：序文 小型}化により、単一の携帯型デバイスへの小型化が実現し、医療診断を臨床現場だけでなく、オフィスや家庭にも導入できるようになった。^{[ 2 ]：序文}臨床検査室には高い信頼性が求められ、診断には認定が必要な場合や、医療機器規制の対象となる場合がある。^{[ 15 ]} 2011年現在しかし、米国の一部の臨床検査機関は、「研究用のみ」として販売されている検査法を使用していた。^{[ 16 ]}

検査室のプロセスは、米国における臨床検査改善法、医療保険の携行性と説明責任に関する法律、優良検査基準、食品医薬品局の仕様などの規制を遵守する必要があります。検査情報管理システムは、これらのプロセスを追跡することで役立ちます。^{[ 17 ]}規制は、職員と備品の両方に適用されます。2012年現在12の米国州では分子病理医に免許取得を義務付けており、米国医学遺伝学委員会や米国病理学委員会などのいくつかの委員会が技術者、監督者、検査室長を認定している。^{[ 18 ]}

自動化とサンプルバーコード化により、処理能力が最大化され、手作業による取り扱いや結果報告中のエラーや汚染の可能性が低減されます。アッセイを最初から最後まで行う単一のデバイスが現在利用可能です。^{[ 15 ]}

分子診断では、 PCR- ELISAや蛍光in situハイブリダイゼーションなどのin vitro生物学的アッセイが用いられます。^{[ 19 ] [ 20 ]}このアッセイでは、患者から採取したサンプル中の、疾患またはリスクのマーカーとなる分子（多くの場合低濃度）を検出します。分析前のサンプルの保存は非常に重要です。手作業による取り扱いは最小限に抑える必要があります。^{[ 21 ]}脆弱なRNA分子は、いくつかの課題を抱えています。RNAは、遺伝子をタンパク質として発現させる細胞プロセスの一部として、遺伝子発現の指標となりますが、常に存在するRNase酵素による加水分解や分解を受けやすい性質があります。サンプルは、液体窒素で急速凍結するか、保存剤中でインキュベートすることができます。^{[ 2 ]： ch 39}

分子診断法は高感度マーカーを検出できるため、これらの検査は従来の生検よりも侵襲性が低い。たとえば、ヒト血漿中に無細胞核酸が存在するため、簡単な血液サンプルで腫瘍、移植、または胎児から遺伝情報を採取できる。^{[ 2 ]： ch45}核酸検出に基づく分子診断法の多くは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して核酸分子の数を大幅に増やし、それによって患者サンプル中の標的配列を増幅するが、すべてではない。^{[ 2 ]： foreword} PCRは、合成プライマー、DNAポリメラーゼ、およびdNTPを使用してテンプレートDNAを増幅する方法である。混合物は、少なくとも2つの温度の間でサイクルされる。高温は二本鎖DNAを一本鎖分子に変性させ、低温はプライマーがテンプレートにハイブリダイズし、ポリメラーゼがプライマーを伸長する。各温度サイクルで、理論的には標的配列の量が2倍になる。 PCR を用いた配列変異の検出では、通常、野生型配列よりも目的の変異をより効率的に増幅するオリゴヌクレオチド試薬の設計と使用が伴います。PCR は現在、DNA 配列の検出に最も広く使用されている方法です。^{[ 22 ]}マーカーの検出には、リアルタイム PCR、直接シーケンス、^{[ 2 ] : ch 17}マイクロアレイ チップ（一度に多くのマーカーをテストする既製チップ）、^{[ 2 ] : ch 24}または MALDI-TOF ^{[ 23 ]}が使用される場合があります。同じ原理がプロテオームとゲノムにも適用されます。ハイスループット プロテイン アレイは、相補的 DNAまたは抗体を使用して結合できるため、多くの異なるタンパク質を並行して検出できます。^{[ 24 ]}分子診断検査は、感度、ターンアラウンド タイム、コスト、カバレッジ、規制当局の承認において大きく異なります。また、それらを使用する検査室で適用される検証のレベルも異なります。したがって、特に結果が患者の治療決定に役立てられる可能性がある場合は、規制要件に従った堅牢なローカル検証と適切な管理の使用が求められる。^{[ 25 ]}

利点

ダウン症候群などの染色体異常に対する従来の出生前検査は、染色体の数と外観（核型）の分析に依存している。マイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの分子診断検査は、代わりにDNAサンプルを検査し、血漿中の無細胞DNAのため侵襲性が低い可能性があるが、2013年時点では依然として従来の検査の補助的なものとなっている。^{[ 26 ]}

患者の一塩基多型（ DNAのわずかな違い）の中には、特定の薬剤をどのくらいの速さで代謝するかを予測するのに役立つものがあり、これは薬理ゲノミクスと呼ばれています。^{[ 27 ]}例えば、CYP2C19酵素は、抗凝固剤クロピドグレルなどのいくつかの薬剤を活性型に代謝します。一部の患者は、2C19遺伝子の特定の場所に多型を持っており、これらの薬剤の代謝が遅い傾向があります。医師はこれらの多型を検査し、その患者にとって薬剤が十分に有効かどうかを調べることができます。^{[ 28 ]}分子生物学の進歩により、以前は単一の疾患として分類されていた症候群の中には、実際には原因と治療法が全く異なる複数のサブタイプが存在することが明らかになりました。分子診断は、感染症や癌などのサブタイプの診断、またはシルバー・ラッセル症候群などの遺伝的要素を持つ疾患の遺伝子解析に役立ちます。^{[ 1 ] [ 29 ]}

分子診断は、クラミジア^{[ 30 ]} 、インフルエンザウイルス^{[ 31 ]}、結核^{[ 32 ]}などの感染症、またはH1N1ウイルス[33]やSARS-CoV-2[34]などの特定の株を特定するために使用され^{ます。遺伝子}による同定^は迅速に行うことができます。たとえば、ループ媒介等温増幅法はマラリア原虫を診断し、発展途上国でも十分頑丈です^{[ 35 ]} 。しかし、ゲノム解析のこれらの進歩にもかかわらず、2013年現在、感染症は依然として、プロテオーム、バクテリオファージ、またはクロマトグラフィープロファイルなどの他の手段によって特定されることが多くなっています^{[ 36 ]} 。分子診断は、たとえば、病原体が持つ薬剤耐性遺伝子を検出することによって、病原体の特定の株を理解し、それによって避けるべき治療法を特定するためにも使用されます。^{[ 37 ] [ 36 ]}さらに、メタゲノム次世代シーケンシングに基づくアッセイを実施することで、病原体を偏りなく特定することができる。^{[ 38 ]}

患者のゲノムには、将来病気を発症する確率に影響を与える遺伝性または偶発的な突然変異が含まれている可能性があります。^{[ 27 ]}例えば、リンチ症候群は、患者が大腸がんやその他の癌になりやすい遺伝性疾患です。早期発見により、綿密なモニタリングが可能になり、患者の予後が良好になる可能性が高まります。^{[ 39 ]}心血管リスクは生物学的マーカーによって示され、スクリーニングによって、子供が嚢胞性線維症などの遺伝性疾患を持って生まれるリスクを測定できます。^{[ 40 ]}遺伝子検査は倫理的に複雑です。患者は、自分のリスクを知るストレスを望まないかもしれません。^{[ 41 ]}国民皆保険制度のない国では、既知のリスクによって保険料が上がる可能性があります。^{[ 42 ]}

がんは、腫瘍が制御不能に増殖する原因となる細胞プロセスの変化です。^{[ 27 ]}がん細胞には、 KRASやCTNNB1（β-カテニン）などの癌遺伝子に突然変異がある場合があります。 ^{[ 43 ]}がん細胞の分子シグネチャー（ DNAとそのメッセンジャーRNAによる発現レベル）を分析することで、医師はがんの特徴を把握し、患者に最適な治療法を選択することができます。^{[ 27 ]} 2010年現在、特定のタンパク質マーカー分子に対する抗体アレイを組み込んだアッセイは新興技術であり、一度に多くのマーカーを測定できるこれらのマルチプレックスアッセイに期待が寄せられています。^{[ 44 ]}将来のバイオマーカー候補には、がん細胞が健康な細胞よりも多く発現するマイクロRNA分子などがあります。 ^{[ 45 ]}

がんは、分子レベルでの原因が多岐にわたり、常に変化し続ける病気です。また、個人内でも病気の多様性が見られます。がんの分子生物学的研究により、腫瘍の増殖と転移におけるドライバー変異の重要性が証明されています。^{[ 46 ]}がん研究のために、配列変異を検出するための多くの技術が開発されてきました。これらの技術は、一般的にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング（NGS）の3つのアプローチに分類できます。^{[ 22 ]}現在、多くのPCRおよびハイブリダイゼーションアッセイがFDAによって体外診断薬として承認されています。^{[ 47 ]}しかし、NGSアッセイは臨床診断においてはまだ初期段階にあります。^{[ 48 ]}

がんの分子診断検査を行う上で重要な課題の一つは、DNA配列変異の検出です。診断に使用される腫瘍生検サンプルには、野生型配列と比較して、標的変異がわずか5%しか含まれていません。また、末梢血や尿からの非侵襲的なアプリケーションでは、DNA検査は0.1%未満の変異アレル頻度での変異を検出できるほど特異性が高くなければなりません。^{[ 22 ]}

現在、従来のPCRを最適化することで、増幅抵抗性変異システム（ARMS）という新しい発明が生まれ、がんにおけるDNA配列変異を検出する方法となっている。ARMSの原理は、DNAポリメラーゼの酵素的伸長活性がプライマーの3'末端付近のミスマッチに非常に敏感であるということである。^{[ 22 ]}多くの企業がARMS PCRプライマーに基づく診断検査を開発している。例えば、Qiagen therascreen ^{[ 49 ]} 、 Roche cobas ^{[ 50 ]}、Biomerieux THxID ^{[ 51 ]}は、 KRAS、EGFR、BRAF遺伝子の肺がん、結腸がん、転移性黒色腫の変異を検出するためのFDA承認PCR検査を開発している。これらのIVDキットは基本的にFFPE組織から抽出したゲノムDNAで検証されている。

ハイブリダイゼーション機構を利用して癌を診断するマイクロアレイもあります。AffymetrixのGenechipテクノロジーでは、1ウェルあたり1～10コピーのmRNAを検出限界として、100万種類以上のプローブをアレイ上に合成できます。^{[ 22 ]}最適化されたマイクロアレイは、通常、さまざまなターゲットの再現性のある相対定量を生成すると考えられています。^{[ 52 ]}現在、FDAはマイクロアレイを利用した診断アッセイを多数承認しています。AgendiaのMammaPrintアッセイは、乳癌に関連する70個の遺伝子の発現をプロファイリングすることで、乳癌の再発リスクを知らせることができます。^{[ 53 ]} Autogenomics INFNITI CYP2C19アッセイは、抗うつ薬に対する治療反応に大きな影響を与える遺伝子多型をプロファイリングできます。^{[ 54 ]}また、AffymetrixのCytoScan Dxは、染色体変異を分析することで、知的障害や先天性疾患を評価できます。^{[ 55 ]}

将来、がんの診断ツールは次世代シーケンシング（NGS）に重点を置くようになるだろう。DNAおよびRNAシーケンシングを利用してがんの診断を行うことで、分子診断ツールの分野の技術はより良く発展するだろう。NGSのスループットと価格は過去10年間で約100分の1に劇的に低下したが、全ゲノムレベルでのディープシーケンシングを実行するには、少なくとも6桁の差がある。^{[ 22 ]}現在、Ion Torrentは、翻訳AmpliSeqに基づくNGSパネルをいくつか開発しており、たとえばOncomine Comprehensive Assayなどがある。^{[ 56 ]}彼らは、がん関連遺伝子のディープシーケンシングを利用して、希少な配列変異を検出することに重点を置いている。

分子診断ツールは、がんのリスク評価に使用できます。たとえば、Myriad Genetics の BRCA1/2 テストは、女性の生涯乳がんリスクを評価します。^{[ 22 ]}また、一部のがんは必ずしも明確な症状を伴いません。明らかな症状を示さない人を分析することは、がんを早期に発見するのに役立ちます。たとえば、ColoGuard テストは、55 歳以上の人の大腸がんのスクリーニングに使用できます。^{[ 57 ]}がんはさまざまな進行段階を持つ長期にわたる疾患であり、分子診断ツールはがんの進行の予後に使用できます。たとえば、Genomic Health の OncoType Dx テストは、乳がんのリスクを推定できます。同社の技術は、乳がん生検組織の RNA 発現レベルを調べることで、必要に応じて化学療法を受けるよう患者に知らせることができます。^{[ 58 ]}

DNA分子診断に対する政府支援の拡大に伴い、がんの臨床DNA検出検査法が今後ますます多く利用可能になると予想されます。現在、がん診断の研究は急速に進展しており、医師と患者にとってより低コストで、より短時間で、より簡便な方法となることを目指しています。

分子診断は、アレルギー学、特に食物アレルギーや呼吸器アレルギーにおいてますます広く用いられています。従来の診断は、臨床歴、皮膚プリックテスト、および全アレルゲン抽出物に対する血清アレルゲン特異的IgEの測定に基づいています。分子ベースのアレルギー診断（コンポーネント分解診断とも呼ばれる）は、抽出物だけでなく個々のアレルゲン分子に対するIgEを測定します。これにより、真の感作と交差反応を区別し、一部のアレルギーにおける臨床リスクの評価を精緻化し、アレルゲン免疫療法に関する決定を支援することができます。Allergy Explorer（ALEX）などのマルチプレックスプラットフォームは、1回の検査で多くのアレルゲン抽出物および分子成分に対するIgE反応性を検査できます。精密アレルギー分子診断（PAMD®）は、分子IgEプロファイルを使用して予後、リスク評価、および個別化された管理を導く、より広範な診断アプローチですが、結果は患者の臨床歴と合わせて解釈する必要があります。^{[ 59 ]}