Loading article…
生物学および生化学において、活性部位とは、基質分子が結合して化学反応を起こす酵素の領域のことである。活性部位は、基質と一時的な結合を形成するアミノ酸残基（結合部位）と、その基質の反応を触媒する残基（触媒部位）から構成される。活性部位は酵素の体積の約10～20%しか占めていないが、[ 1 ] : 19化学反応を直接触媒するため、最も重要な部分である。活性部位は通常3～4個のアミノ酸から構成され、タンパク質内の他のアミノ酸は酵素の三次構造を維持するために必要である。 [ 2 ]
各活性部位は、特定の基質に結合して特定の反応を触媒するように最適化されるように進化しており、高い特異性をもたらします。この特異性は、活性部位内のアミノ酸の配置と基質の構造によって決定されます。酵素は、その機能を果たすために、補因子と結合する必要がある場合もあります。活性部位は通常、酵素の溝またはポケットであり、酵素内の深いトンネル[ 3 ] 、または多量体酵素の界面の間に位置している場合があります。活性部位は、反応の最後に残基が変化しないため（反応中に変化する可能性はありますが、最後に再生されます）、反応を繰り返し触媒することができます[ 4 ] 。このプロセスは、反応の活性化エネルギーを低下させることによって達成され、より多くの基質が反応を起こすのに十分なエネルギーを持つようになります。
通常、酵素分子には活性部位が1つしかなく、その活性部位は特定の種類の基質に適合します。活性部位には、基質を結合して触媒作用に適した向きにする結合部位があります。基質の向きと基質と活性部位との近接性は非常に重要であるため、場合によっては、他のすべての部分が変異して機能を失ったとしても、酵素は正常に機能し続けることができます。[ 5 ]
最初は、活性部位と基質の相互作用は非共有結合で一時的なものです。基質を特定の向きに保持し、酵素-基質複合体（ES複合体）を形成する重要な相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用の4種類があります。[ 6 ]： 148基質と活性部位の電荷分布は相補的でなければならず、つまり、すべての正電荷と負電荷が打ち消し合わなければなりません。そうでないと、反発力が働き、基質同士が離れてしまいます。活性部位には通常、非極性アミノ酸が含まれていますが、極性アミノ酸が含まれる場合もあります。[ 2 ]基質が結合部位に結合するには、立体選択性、位置選択性、およびエナンチオ選択性を達成するために、少なくとも3つの接触点が必要です。たとえば、エタノールからNAD +へのヒドリドイオンの転移を触媒するアルコール脱水素酵素は、基質のメチル基、ヒドロキシル基、および反応中に引き抜かれるプロ-（R）水素と相互作用します。 [ 6 ]： 149
酵素がその機能を発揮するためには、正しいタンパク質フォールド（天然フォールド）と三次構造をとる必要があります。この明確な三次元構造を維持するために、タンパク質はアミノ酸残基間の様々な相互作用に依存しています。これらの相互作用が、例えば極端なpH値、高温、高イオン濃度などによって阻害されると、酵素は変性し、触媒活性を失います。
活性部位と基質分子の密着度が高いほど、反応効率が向上すると考えられている。DNAポリメラーゼの活性部位と基質の密着度が高ければ、DNA複製の正確速度、すなわち忠実度も高くなる。[ 7 ]ほとんどの酵素は活性部位が奥深く埋もれており、基質はアクセスチャネルを介して活性部位にアクセスできる。[ 3 ]
酵素が特定の基質にどのように適合するかについては、鍵と鍵穴モデル、誘導適合モデル、および立体構造選択モデルの 3 つのモデルが提案されています。後者 2 つは相互に排他的ではなく、立体構造選択に続いて酵素の形状が変化することがあります。さらに、タンパク質はどちらのモデルにも完全には従わない場合があります。ユビキチンの結合部位のアミノ酸は一般的に誘導適合モデルに従いますが、タンパク質の残りの部分は一般的に立体構造選択に従います。温度などの要因は、結合中にたどられる経路に影響を与える可能性が高く、高温では立体構造選択の重要性が高まり、誘導適合の重要性が低下すると予測されています。[ 8 ]
この概念は、19世紀の化学者エミール・フィッシャーによって提唱された。彼は、活性部位と基質は、鍵が錠にぴったりとはまるように、何の修飾も必要としない、完全に適合する2つの安定した構造であると提唱した。基質が活性部位に完全に結合すれば、両者の相互作用は最も強くなり、高い触媒効率が得られるというのである。
時が経つにつれ、このモデルの限界が明らかになってきた。例えば、競合酵素阻害剤であるメチルグルコシドは、4α-グルカノトランスフェラーゼの活性部位に強く結合し、完全に適合する。しかし、4α-グルカノトランスフェラーゼはメチルグルコシドに対して活性を示さず、グリコシル転移は起こらない。鍵と鍵穴仮説では、メチルグルコシドの強い結合によりグリコシル転移の効率が高くなると予測されるため、この現象を説明できない。競合阻害以外にも、この理論では非競合阻害剤の作用機序も説明できない。非競合阻害剤は活性部位には結合しないが、触媒活性に影響を与えるからである。[ 9 ]
ダニエル・コシュランドの酵素-基質結合理論は、活性部位と基質の結合部分が厳密には相補的ではないというものである。[ 10 ]誘導適合モデルは鍵と鍵穴モデルを発展させたもので、活性部位は柔軟で、基質が完全に結合するまで形状が変化すると仮定している。このモデルは、手袋をはめた人に似ている。手袋は手に合うように形状が変化する。酵素は最初は基質を引き付けるような立体構造をしている。酵素表面は柔軟で、適切な触媒のみが相互作用を誘発し、触媒作用につながる。基質が結合すると立体構造の変化が起こる可能性がある。反応後、生成物は酵素から離れ、活性部位は元の形状に戻る。この仮説は、触媒作用中にタンパク質ドメイン全体が数ナノメートル移動する可能性があるという観察によって裏付けられている。タンパク質表面のこの動きは、触媒作用に有利な微小環境を作り出すことができる。[ 5 ]
このモデルは、酵素がさまざまな立体構造で存在し、そのうちのいくつかだけが基質に結合できることを示唆している。基質がタンパク質に結合すると、立体構造のアンサンブルの平衡はリガンドに結合できる方向にシフトする（基質が結合した酵素は、自由な立体構造間の平衡から除外されるため）。[ 11 ]
静電相互作用：水溶液中では、活性部位と基質内のアミノ酸側鎖にある反対の電荷を持つ基が互いに引き合います。これを静電相互作用と呼びます。例えば、カルボン酸（R-COOH）がRCOO−とH+イオンに解離すると、 COO−はアルギニンのプロトン化されたグアニジン側鎖などの正に帯電した基を引き付けます。
水素結合：水素結合とは、部分的に正電荷を帯びた水素原子と、酸素、フッ素、窒素などの電子対を持つ部分的に負電荷を帯びた電子供与体との間の、特殊な双極子-双極子相互作用のことです。水素結合の強さは、それぞれの原子団の化学的性質と幾何学的配置によって決まります。
ファンデルワールス力：ファンデルワールス力は、各グループにおける一時的な不均一な電子分布によって、反対の電荷を持つグループ間に生じます。すべての電子がグループの一方の極に集中すると、その端は負に帯電し、もう一方の端は正に帯電します。個々の力は弱いものの、活性部位と基質間の相互作用の総数は膨大であるため、それらの合計は無視できない力となります。
疎水性相互作用：非極性の疎水性基は、水溶液中で凝集する傾向があり、極性溶媒から離れようとします。これらの疎水性基は通常、長い炭素鎖を持ち、水分子とは反応しません。タンパク質分子が水に溶解すると、球状に丸まり、親水性基が外側に、疎水性基が中心部に深く埋もれます。
基質が結合して活性部位に配向されると、触媒反応が開始される。触媒部位の残基は通常、結合部位のすぐ近くに位置しており、一部の残基は結合と触媒反応の両方において二重の役割を果たすことがある。
反応部位の触媒残基は基質と相互作用することで反応の活性化エネルギーを低下させ、反応速度を速めます。これは、反応物の接近、求核触媒作用／求電子触媒作用、酸／塩基触媒作用など、様々なメカニズムによって実現されます。これらのメカニズムについては、以下で詳しく説明します。
酵素触媒反応中、基質と活性部位は近接して配置されます。このアプローチには様々な目的があります。まず、基質が活性部位に結合すると、溶液中よりも有効濃度が大幅に増加します。これは、反応に関与する基質分子の数も増加することを意味します。このプロセスは、反応に必要な脱溶媒和エネルギーも減少させます。溶液中では、基質分子は溶媒分子に囲まれており、酵素分子が溶媒分子と置き換わって基質と接触するにはエネルギーが必要です。活性部位からバルク分子を排除できるため、このエネルギー出力は最小限に抑えられます。次に、活性部位は、反応の活性化エネルギーを減少させるために基質の配向を変えるように設計されています。結合後の基質の配向は高エネルギー状態に固定され、次のステップに進むことができます。さらに、溶媒が活性部位に入り込めないため、溶液反応に伴うエネルギーコストが大幅に削減され、エントロピー的に有利になります。最終的に、活性部位は基質の分子軌道を適切な配向に操作して活性化エネルギーを減少させる可能性があります。[ 6 ]： 155-8
基質と活性部位の静電状態は互いに相補的でなければならない。負に帯電したアミノ酸側鎖は、電荷を持たない基質を反発する。しかし、遷移状態がイオン中心の形成を伴う場合、側鎖は好ましい相互作用を生み出すことになる。
セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテインキナーゼ、ホスファターゼなど多くの酵素は、活性化エネルギーを低下させて反応を起こせるように、基質との間に一時的な共有結合を形成するように進化してきた。このプロセスは、形成と分解の2つの段階に分けられる。前者の段階は律速段階であり、後者の段階は完全な酵素を再生するために必要である。[ 6 ]： 158
求核触媒作用：このプロセスでは、遷移状態中に酵素の求核剤から基質に電子が供与され、両者の間に共有結合が形成されます。この相互作用の強さは、求核基が電子を供与する能力と求電子剤が電子を受け入れる能力という2つの側面に依存します。前者は主にその種の塩基性（電子対を供与する能力）に影響され、後者はそのp Kaに関係します。両方のグループは、分極率、電気陰性度、イオン化ポテンシャルなどの化学的性質にも影響されます。求核剤を形成できるアミノ酸には、セリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミンなどがあります。
求電子触媒反応：この反応のメカニズムは求核触媒反応と全く同じですが、活性部位のアミノ酸が求電子剤として働き、基質が求核剤として働く点が異なります。アミノ酸側鎖は電子を引き付ける力が弱いため、この反応には通常補因子が必要です。
金属イオンは反応中に複数の役割を担う。まず、負に帯電した基質基に結合することで、活性部位の求核基から電子対が反発されるのを防ぐ。また、負に帯電した電子を引き付けて求電子性を高める。さらに、活性部位と基質の間を架橋する役割も果たす。最後に、基質の立体配座構造を変化させて反応を促進する可能性もある。 [ 6 ]： 158
一部の反応では、プロトンと水酸化物イオンが、特異的酸触媒作用と特異的塩基触媒作用の観点から、直接酸と塩基として作用することがあります。しかし、多くの場合、基質と活性部位の基がブレンステッド・ローリー酸と塩基として作用します。これは一般酸理論と一般塩基理論と呼ばれます。両者を区別する最も簡単な方法は、反応速度が一般酸と一般塩基の濃度によって決定されるかどうかを確認することです。もしそうであれば、その反応は一般型です。ほとんどの酵素は最適pHが6～7であるため、側鎖のアミノ酸は通常pKaが4～10です。候補としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システインなどが挙げられます。これらの酸と塩基は、触媒作用中に生成される求核剤または求電子剤に正電荷と負電荷を与えることで安定化させることができます。[ 6 ]： 164～70
酵素反応の定量的研究では、化学反応速度の加速は、近似理論、酸塩基触媒作用、求電子剤／求核剤触媒作用といった既存の理論では十分に説明できないことがしばしば見出された。そして、明らかなパラドックスが存在する。可逆的な酵素反応において、活性部位が基質に完全に適合する場合、生成物が活性部位に完全に適合できないため、逆反応は遅くなる。そこで、立体配座の歪みという概念が導入され、活性部位と基質の両方が常に互いに適合するように立体配座変化を起こすことができると主張されている。[ 6 ]： 170-5
この理論は鍵と鍵穴理論に少し似ていますが、この段階では活性部位は基底状態ではなく遷移状態において基質に完全に結合するようにあらかじめプログラムされています。溶液中で遷移状態を形成するには、溶媒分子を再配置するために大量のエネルギーが必要となり、反応速度が低下します。そのため、活性部位は溶媒分子を置き換えて基質を取り囲み、溶液によって生じる逆効果を最小限に抑えることができます。活性部位に荷電基が存在すると、基質を引き付け、静電的な相補性を確保します。[ 6 ]： 176-8
実際には、ほとんどの酵素反応機構は、複数の異なるタイプの触媒作用の組み合わせによって成り立っている。
グルタチオン（GSH）の役割は、細胞に損傷を与える可能性のある蓄積した活性酸素種を除去することです。この過程で、グルタチオンのチオール側鎖が酸化され、2つのグルタチオン分子がジスルフィド結合で結合して二量体（GSSG）を形成します。グルタチオンを再生するには、ジスルフィド結合を切断する必要があります。ヒト細胞では、これはグルタチオン還元酵素（GR）によって行われます。
グルタチオン還元酵素は、2つの同一のサブユニットからなる二量体です。補因子としてNADPとFADをそれぞれ1つずつ必要とします。活性部位は、2つのサブユニット間の結合部に位置しています。NADPHはFADH-の生成に関与します。活性部位には、FAD補因子の他に2つのシステイン残基があり、触媒反応中にジスルフィド結合を切断するために使用されます。NADPHは、Arg-218、His-219、Arg-224という3つの正電荷を持つ残基によって結合されます。
触媒反応は、FADがNADPHによって還元されてFADH−から電子を1つ受け取るところから始まります。次に、2つのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合を攻撃し、1つのSH結合と1つのS−基を形成します。このS−基は求核剤として働き、酸化型グルタチオン（GSSG）のジスルフィド結合を攻撃してこれを切断し、システイン-SG複合体を形成します。最初のSG−アニオンが放出され、隣接するSH基と最初のグルタチオンモノマーからプロトンを1つ受け取ります。次に、隣接するS−基がシステイン-SG複合体のジスルフィド結合を攻撃し、2番目のSG−アニオンを放出します。これは溶液中でプロトンを1つ受け取り、2番目のグルタチオンモノマーを形成します。
[ 1 ]： 137-9
キモトリプシンは、膵液中に存在するセリンエンドペプチダーゼであり、タンパク質やペプチドの加水分解を助けます。[ 1 ]： 84-6チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンのL-異性体のペプチド結合の加水分解を触媒します。この酵素の活性部位では、3つのアミノ酸残基が協働して触媒三残基を形成し、触媒部位を構成します。キモトリプシンでは、これらの残基はSer-195、His-57、Asp-102です。
キモトリプシンの作用機序は2つの段階に分けられる。まず、Ser-195が基質中のペプチド結合炭素に求核攻撃を行い、四面体中間体を形成する。Ser-195の求核性はHis-57によって増強され、His-57はSer-195からプロトンを引き抜き、さらにAsp-102の負電荷を帯びたカルボキシル基（RCOO− ）によって安定化される。さらに、この段階で生成された四面体オキシアニオン中間体は、Ser-195とGly-193からの水素結合によって安定化される。
第2段階では、R'NH基がHis-57によってプロトン化されてR'NH₂となり、中間体から離脱し、アシル化されたSer-195が残ります。次に、His-57は再び塩基として働き、水分子からプロトンを1つ引き抜きます。生成した水酸化物アニオンは、アシル酵素複合体を求核攻撃し、2番目の四面体オキシアニオン中間体を形成します。この中間体は、再び水素結合によって安定化されます。最後に、Ser-195が四面体中間体から離脱し、酵素とペプチド基質をつないでいたCO結合が切断されます。His-57を介してSer-195にプロトンが移動し、3つのアミノ酸すべてが元の状態に戻ります。
基質の解離はさまざまな要因によって影響を受ける。一般的に、より大きなリガンドは活性部位に長く留まり、[ 12 ]回転可能な結合が多いリガンドも同様である（ただし、これはサイズの副次的効果である可能性がある）。[ 13 ]溶媒が活性部位から排除されると、柔軟性の低いタンパク質は滞留時間が長くなる。溶媒から遮蔽された水素結合が多いほど、解離も減少する。[ 12 ]
酵素は補因子を「ヘルパー分子」として利用できます。補酵素とは、酵素に結合してその働きを助ける非タンパク質分子のことです。ほとんどの場合、補酵素は水素結合や疎水性相互作用などの非共有結合によって活性部位に結合しています。しかし、時には共有結合が形成されることもあります。例えば、シトクロムCのヘムはチオエステル結合によってタンパク質に結合しています。場合によっては、補酵素は反応終了後に酵素から離れることがあります。そうでない場合は、補酵素は酵素に永久的に結合します。[ 6 ]： 69補酵素は、金属イオン、さまざまなビタミン、ATPを含む広い概念です。酵素が自ら働くために補酵素を必要とする場合、それはアポ酵素と呼ばれます。実際、それ自体では反応を適切に触媒することはできません。補因子がやってきて活性部位に結合し、ホロ酵素を形成したときにのみ、適切に機能します。
補酵素の一例としてフラビンが挙げられます。フラビンは、独特な共役イソアロキサジン環系を有しています。フラビンは複数の酸化還元状態を持ち、1個または2個の電子の移動を伴う反応に利用できます。NADからNADHへの酸化反応のように、電子受容体として働き、2個の電子を受け取って1,5-ジヒドロフラビンを形成することができます。一方、 1個の電子を受け取ってセミキノン（フリーラジカル）を形成し、さらに電子を1個加えることで完全に還元された形態に変換されます。この性質により、1電子酸化反応にも利用できます。
阻害剤は酵素と基質の相互作用を阻害し、反応速度を低下させる。阻害剤には可逆的なものと不可逆的なものなど、様々な種類がある。
競合阻害剤は、遊離酵素分子のみを標的とする阻害剤です。これらは遊離酵素受容体をめぐって基質と競合し、基質濃度を上げることで阻害を克服できます。競合阻害剤には2つの作用機序があります。競合阻害剤は通常、基質やES複合体と構造的に類似しています。そのため、活性部位に結合して好ましい相互作用を引き起こし、その空間を埋めて基質の侵入を阻害します。また、活性部位に一時的な立体構造変化を誘発し、基質が完全に結合できないようにすることもできます。短時間後、競合阻害剤は脱離し、酵素はそのまま残ります。
阻害剤は、遊離酵素とES複合体の両方に結合する場合、非競合阻害剤に分類されます。活性部位をめぐって基質と競合しないため、基質濃度を単純に増加させても阻害効果は打ち消されません。通常、阻害剤は酵素上の別の部位に結合し、活性部位の三次元構造を変化させることで、基質が酵素に出入りするのを阻害します。
不可逆阻害剤は、活性部位に結合するという点で競合阻害剤と類似しています。しかし、不可逆阻害剤は活性部位のアミノ酸残基と不可逆的な共有結合を形成し、決して解離しません。そのため、活性部位は阻害剤で占有され、基質は結合できません。まれに阻害剤が解離することもありますが、その場合、触媒部位の形状は永久的に変化します。これらの阻害剤は通常、ハロゲン置換基やエポキシドなどの求電子性基を含んでいます。時間が経つにつれて、不可逆阻害剤に結合した酵素が増え、機能しなくなってしまうのです。
HIVプロテアーゼ阻害剤は、エイズウイルスのDNA複製を阻害することで、エイズウイルスに感染した患者の治療に使用されます。HIVプロテアーゼは、ウイルスがGag-Polポリタンパク質を3つの小さなタンパク質に切断するために使用され、これらのタンパク質はビリオンの組み立て、パッケージング、成熟に関与しています。この酵素は、標的タンパク質内の特定のフェニルアラニン-プロリン切断部位を標的とします。 [ 14 ] HIVプロテアーゼがオフになると、ビリオン粒子は機能を失い、患者に感染できなくなります。ウイルス複製に不可欠であり、健康なヒトには存在しないため、創薬の理想的な標的となります。
HIVプロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属し、同様のメカニズムを持つ。まず、アスパラギン酸残基が水分子を活性化し、求核剤に変える。次に、ペプチド結合（NH-CO）内のカルボニル基を攻撃して四面体中間体を形成する。中間体内の窒素原子がプロトンを受け取り、アミド基を形成し、その後の再配列により、中間体との結合が切断され、2つの生成物が形成される。[ 15 ]
阻害剤は通常、四面体中間体を模倣する非加水分解性のヒドロキシエチレン基またはヒドロキシエチルアミン基を含んでいる。これらは基質の遷移状態と類似した構造と静電配置を持つため、活性部位に結合できるが分解されないため、加水分解は起こらない。
ストリキニーネは、筋肉の収縮を制御する神経に作用し、呼吸困難を引き起こすことで死に至る神経毒です。神経インパルスは、アセチルコリンと呼ばれる神経伝達物質を介してシナプス間で伝達されます。アセチルコリンは神経細胞間のシナプスに放出され、シナプス後細胞の受容体に結合します。すると活動電位が発生し、シナプス後細胞を介して伝達され、新たなサイクルが始まります。
グリシンは神経伝達物質受容体の活性を阻害するため、活動電位を誘発するにはより多くのアセチルコリンエステラーゼが必要になります。これにより、神経インパルスの発生が厳密に制御されます。しかし、ストリキニーネを加えるとこの制御が崩れます。ストリキニーネはグリシン受容体（塩化物チャネル）を阻害し、はるかに低いレベルの神経伝達物質濃度で活動電位を誘発することができます。神経は絶えず信号を伝達し、過剰な筋肉収縮を引き起こし、窒息と死に至ります。 [ 16 ]
ジイソプロピルフルオロホスフェート（DIFP）は、セリンプロテアーゼの作用を阻害する不可逆的阻害剤です。DIFPが酵素に結合すると、求核置換反応が起こり、1分子のフッ化水素が放出されます。活性部位のOH基は求核剤として働き、DIFPのリンを攻撃して四面体中間体を形成し、プロトンを放出します。次にPF結合が切断され、1つの電子がF原子に移動し、F−アニオンとして中間体から放出されます。これは溶液中のプロトンと結合して1分子のHFを形成します。活性部位とDIFPの間に共有結合が形成されるため、セリン側鎖は基質に利用できなくなります。[ 17 ]
活性部位の特定は創薬プロセスにおいて極めて重要である。酵素の3D構造を解析して活性部位残基を特定し、それらに適合する薬剤を設計する。タンパク質分解酵素は、プロテアーゼ阻害剤など、いくつかの薬剤の標的となっている。これには、エイズや高血圧に対する薬剤が含まれる。[ 18 ]これらのプロテアーゼ阻害剤は、酵素の活性部位に結合し、天然基質との相互作用を阻害する。[ 19 ]薬剤設計における重要な要素は、活性部位と酵素阻害剤との結合の強さである。[ 20 ]細菌に見られる酵素がヒトの酵素と大きく異なる場合、ヒトの酵素に害を与えることなく、その特定の細菌に対する阻害剤を設計することができる。ある種の酵素が特定の生物にのみ存在する場合、その阻害剤を使用して、その生物を特異的に除去することができる。
活性部位をマッピングすることで、酵素阻害剤などの新薬の設計に役立てることができます。これには、活性部位のサイズ、サブサイトの数と特性、結合相互作用の詳細などの記述が含まれます。[ 18 ]しかし、CPASS（Comparison of Protein Active Site Structures）と呼ばれる最新のデータベース技術では、ソフトウェアを使用して活性部位をより詳細に比較し、構造的類似性を見つけることが可能です。[ 21 ]
アロステリック部位とは、酵素の活性部位とは無関係な部位で、エフェクター分子が結合できる部位のことです。この相互作用は、酵素調節のもう一つのメカニズムです。アロステリック修飾は通常、複数のサブユニットを持つタンパク質で起こります。アロステリック相互作用は代謝経路によく見られ、反応のある段階が別の段階を調節できるという点で有益です。[ 19 ]これにより、酵素は、非常に特異的な活性部位以外にも、さまざまな分子間相互作用を持つことができます。[ 19 ]